वर्तमान†वर्तमान पता: OX11 0DE, यूके, डायमंड बिल्डिंग, हार्वेल साइंस एंड इनोवेशन पार्क, डायटकोट, ऑक्सफोर्डशायर, यूके, डायमंड लाइट सोर्स कंपनी, लिमिटेड, इलेक्ट्रॉनिक बायोलॉजिकल इमेजिंग सेंटर।
रिएक्शन सेंटर लाइट-हार्वेस्टिंग कॉम्प्लेक्स 1 (RC-LH1) बैंगनी रंग के फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया सभ के कोर फोटोसिंथेटिक घटक हवे। हमनी के रोडोप्स्यूडोमोनास पैलुस्ट्रिस से आरसी-एलएच1 परिसर के दुगो क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संरचना पेश कईनी। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स के 2.65-Å रिजोल्यूशन संरचना में आरसी के चारो ओर 14 गो सबयूनिट एलएच1 लूप होलें, जे प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा बाधित होलें जबकि प्रोटीन-डब्ल्यू के बिना कॉम्प्लेक्स पूरा तरीका से आरसी से घिरल आरसी रचना होला। 16 सबयूनिट एलएच1 लूप बंद हो गइल। एह संरचना सभ के तुलना से आरसी-एलएच1 परिसर में क्विनोन के गतिशीलता के बारे में जानकारी मिले ला, जवना में आरसी क्यूबी साइट पर क्विनोन के बाइंडिंग करे के समय पहिले से अनिर्धारित संरचनात्मक बदलाव के साथे-साथ सहायक क्विनोन बाइंडिंग साइट सभ के लोकेशन भी सामिल बा, जे इनहन के आरसी में पास करे में मदद करे लें। डब्ल्यू प्रोटीन के बिसेस संरचना LH1 लूप के बंद होखे से रोके ले, जेकरा से क्विनोन/क्विनोलोन के आदान-प्रदान के गति देवे खातिर एगो चैनल बने ला।
प्रकाश संश्लेषण से मिले वाली ऊर्जा पृथ्वी पर लगभग सगरी जीवन के बरकरार रख सके ले आ एकरा में सौर जैव प्रौद्योगिकी खातिर बहुत संभावना बा। वैश्विक प्रकाश संश्लेषण के बढ़ावा देवे के साथ-साथ बैंगनी रंग के फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया सभ में भी बिबिध ऊर्जा मोड आ मेटाबोलिक क्षमता सभ के परदरशन होला। ई प्रकाश संश्लेषण से बच सके लीं आ अन्हार में हेटरोट्रोफिक बैक्टीरिया के रूप में बढ़ सके लीं, नाइट्रोजन आ कार्बन डाइऑक्साइड के ठीक क सके लीं, हाइड्रोजन पैदा क सके लीं आ सुगंधित यौगिक सभ के बिघटन क सके लीं (1-3)। एह प्रक्रिया सभ खातिर ऊर्जा उपलब्ध करावे खातिर प्रकाश के जल्दी आ कुशलता से रासायनिक ऊर्जा में बदले के पड़े ला। ई प्रक्रिया तब शुरू होला जब लाइट-ट्रैपिंग एंटीना कॉम्प्लेक्स प्रकाश के सोख लेला आ फंसल ऊर्जा के रिएक्शन सेंटर (RC) में स्थानांतरित क देला, जेकरा से चार्ज अलगाव शुरू हो जाला (4 – 7)। बैंगनी रंग के फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया में प्रकाश संश्लेषण के मूल इकाई टाइप 2 आरसी से बनल होले, जे लाइट-हार्वेस्टिंग कॉम्प्लेक्स 1 (LH1) से घिरल होले, जेकरा से आरसी-एलएच1 कोर कॉम्प्लेक्स बने ला। LH1 घुमावदार αβ हेटरोडाइमर सभ के सरणी से बने ला, इनहन में से हर एक दू गो बैक्टीरियल क्लोरोफिल (BChl) a अणु आ एक या दू गो कैरोटीनॉइड (8-12) सभ के बाँधे ला। सबसे सरल LH1 एंटीना में 16 या 17 αβ हेटरोडाइमर होलें जे बंद लूप में आरसी (9-13) के घेरले होलें, बाकी अन्य कोर कॉम्प्लेक्स सभ में, ट्रांसमेम्ब्रेन पेप्टाइड सभ आसपास के LH1 के निरंतरता के बाधित करे लें, जेकरा से आरसी आ साइटोक्रोम bc1 कॉम्प्लेक्स के बीच क्विनोल/क्विनोन प्रसार के बढ़ावा मिले ला (11, 13-15 के बा)। बैंगनी रंग के फोटोट्रोफिक पौधा रोडोप्स्यूडोमोनास (Rps.) एगो मॉडल जीव हवे जे ऊर्जा आ इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर के समझ सके ला जे प्रकाश संश्लेषण के समर्थन करे ला। आरपीएस के पहिला क्रिस्टल संरचना। पैलुस्ट्रिस आरसी-एलएच1 कॉम्प्लेक्स के मॉडल आरसी हवे, जेकरा चारो ओर 15 गो हेटरोडाइमेरिक एलएच1 लूप बाड़ें, जिनहन के एगो अज्ञात प्रोटीन द्वारा बाधित कइल जाला जेकरा के “प्रोटीन डब्ल्यू” (14) कहल जाला। बाद में प्रोटीन-डब्ल्यू के पहचान RPA4402 के रूप में कइल गइल, जवन तीन गो अनुमानित ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स (TMH) के साथ एगो बिना विशेषता वाला 10.5kDa प्रोटीन हवे ( 16 )। हमनी के प्रस्ताव बा कि प्रोटीन डब्ल्यू के एन्कोडिंग करे वाला rpa4402 जीन के नाम बदल के pufW कर दिहल जाव ताकि ई आरसी-एल, एम (pufL, pufM) आ LH1α, β (pufA, pufB) सबयूनिट के एन्कोडिंग करे वाला जीन खातिर इस्तेमाल होखे वाला नामकरण के अनुरूप होखे। मजेदार बात ई बा कि प्रोटीन-डब्ल्यू आरसी-एलएच1 के लगभग 10% में ही मौजूद होला, जवना से आरपीएस के पता चलेला। palustris दू गो अलग-अलग आरसी-एलएच1 परिसर पैदा करे ला। इहाँ, हमनी के दू गो कोर कॉम्प्लेक्स के हाई-रिजोल्यूशन क्रायो-ईएम (क्राइओ-ईएम) संरचना के रिपोर्ट कइले बानी जा, एगो में प्रोटीन डब्ल्यू आ 14 αβ हेटरोडाइमर, दुसरा में प्रोटीन डब्ल्यू आ बंद 16 हेटरोडाइमर एलएच1 लूप। हमनी के संरचना आरपीएस के आरसी-एलएच1 परिसर के समझ में एगो कदम बदलाव के प्रतिनिधित्व करेला। palustris, काहें से कि हमनी के हर वेरिएंट के सजातीय आबादी के बिस्लेषण कइले बानी जा आ हर पेप्टाइड आ बाउंड पिगमेंट आ संबंधित लिपिड आ क्विनोन सभ के साफ-साफ असाइन करे खातिर पर्याप्त रिजोल्यूशन बा। एह संरचना सभ के तुलना से पता चले ला कि अबतक ले कौनों अउरी आरसी-एलएच1 कॉम्प्लेक्स में ना मिलल तीन गो टीएमएच प्रोटीन-डब्ल्यू क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज के तेज करे खातिर क्विनोन चैनल पैदा करे लें। कई गो संरक्षित लिपिड आ क्विनोन बाइंडिंग साइट सभ के पहिचान कइल गइल बा, आ हमनी के क्विनोन आ आरसी के संयोजन के बाद एगो नया संरचनात्मक बदलाव के खुलासा कइले बानी जा, जवन ऑक्सीजनयुक्त फोटोट्रोफिक जीव सभ के फोटोसिस्टम II (PSII) आरसी खातिर उपयुक्त हो सके ला। हमनी के खोज बैंगनी फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया के आरसी-एलएच1 कोर कॉम्प्लेक्स में क्विनोन/क्विनोलोन बाइंडिंग अवुरी एक्सचेंज के गतिकी के बारे में नाया जानकारी देवेला।
ताकि आरपीएस में पावल जाए वाला दुनो परिसर के विस्तृत अध्ययन के सुविधा मिल सके। palustris, हमनी के जैव रासायनिक विधि से हर आरसी-एलएच1 के अलग करेनी जा। प्रोटीन डब्ल्यू के कमी वाला कॉम्प्लेक्स (अब ΔpufW कहल जाला) के pufW जीन (16) के कमी वाला तनाव से शुद्ध कइल गइल, आ खाली एक ठो RC-LH1 कॉम्प्लेक्स के निर्माण कइल जा सके ला। प्रोटीन डब्ल्यू युक्त परिसर एगो तनाव द्वारा बनावल जाला। एह तनाव के प्रोटीन W के एकरे C-टर्मिनस पर 10x His टैग के साथ संशोधित कइल जाला, ताकि प्रोटीन W युक्त कॉम्प्लेक्स के धातु के स्थिर क के ज्यादातर कमी वाला प्रोटीन W के साथ प्रभावी ढंग से जोड़ल जा सके ला। परिसर के प्रभावी ढंग से अलग कइल जाला (16) एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी (IMAC)।
जइसे कि चित्र 1 में देखावल गइल बा, दुनों परिसर सभ में तीन गो सब-यूनिट आरसी (RC-L, RC-M आ RC-H) होला जे LH1 एंटीना से घिरल होला। प्रोटीन-डब्ल्यू के कमी वाला कॉम्प्लेक्स के 2.80-ए संरचना में 16 αβ हेटरोडाइमर देखे के मिले ला, ई आरसी के पूरा तरीका से घेरले बंद LH1 लूप बनावे लें, जेकरा के आगे आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स कहल जाला। प्रोटीन-डब्ल्यू युक्त परिसर के 2.65Å संरचना में 14-हेटरोडाइमर LH1 होला जे प्रोटीन-W द्वारा बाधित होला, एकरे बाद एकरा के RC-LH114-W कहल जाला।
(क आ बी) यौगिक के सतह के प्रतिनिधित्व। (C and D) रॉड में व्यक्त बंधुआ पिगमेंट। (E आ F) साइटोप्लाज्मिक सतह से देखल गइल परिसर सभ में पेप्टाइड आ LH1 सबयूनिट सभ के कार्टून में देखावल गइल बा, आ प्रोटीन-W गैप से घड़ी के दिशा में नंबर दिहल जाला [Rba नंबरिंग के अनुरूप। स्फेरोइड्स परिसर (13) के बा]। LH1-α खातिर प्रोटीन सबयूनिट के रंग पीला होला; LH1-β खातिर प्रोटीन सबयूनिट के रंग नीला होला; प्रोटीन-डब्ल्यू खातिर, प्रोटीन लाल रंग के होला; आरसी-एच खातिर, ई सियान होला; आरसी-एल खातिर ई ऑरेंज होला; आरसी-एम खातिर, मैजेंटा। कोफैक्टर सभ के रॉड से देखावल जाला, हरियर रंग BChl आ BPh a अणु सभ के प्रतिनिधित्व करे ला, बैंगनी रंग कैरोटीनॉइड सभ के प्रतिनिधित्व करे ला आ पीला रंग UQ10 अणु सभ के प्रतिनिधित्व करे ला। (जी आ एच) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (जी) आ आरसी-एलएच116 परिसर (एच) के समतुल्य क्षेत्र में प्रोटीन-डब्ल्यू अंतराल के आवर्धित दृश्य। कोफैक्टर सभ के स्पेस फिलिंग के रूप में देखावल जाला, किलेटेड क्विनोन के नीले रंग में देखावल जाला। प्रोटीन-डब्ल्यू गैप के (G) में नीला डैश लाइन से हाइलाइट कइल गइल बा, आ छोट छेद सभ के जहाँ LH116 रिंग पर क्विनोन/क्विनोलोल के बिस्तार होला, (H) में करिया डैश लाइन से हाइलाइट कइल गइल बा।
चित्र 1 (ए आ बी) में आरसी के LH1αβ हेटरोडाइमर सभ के खुला भा बंद सरणी से घिरल देखावल गइल बा, जेह में से हर एक दू गो BChl आ एक ठो कैरोटीनॉइड (चित्र 1, सी आ डी) के बाँधे ला। पिछला अध्ययन से पता चलल बा कि आरपीएस एलएच1 कॉम्प्लेक्स ह। स्पाइरुलिना ज़ैन्थिन के जैवसंश्लेषण मार्ग में, एह प्रजाति सभ में कैरोटीनॉइड सभ के मिश्रित आबादी होला ( 17 )। हालाँकि, स्पाइरोपाइरोक्सैन्थिन प्रमुख कैरोटीनॉइड हवे आ एकर घनत्व संतोषजनक होला। एहसे हमनी के सभ एलएच 1 बाइंडिंग साइट प स्पाइरोक्सैन्थिन के मॉडलिंग करे के चुननी। अल्फा आ बीटा पॉलीपेप्टाइड एकल टीएमएच हवें जिनहन के झिल्ली के बाहरी क्षेत्र छोट होला (चित्र 1, ए, बी, ई, आ एफ)। हालाँकि, सी-टर्मिनस पर 17 अवशेष सभ के घनत्व ना देखल गइल, अल्फा पॉलीपेप्टाइड के दुनों परिसर सभ में Met1 से Ala46 में बिच्छेद कइल गइल। β पॉलीपेप्टाइड के RC-LH116 में Gly4 से Tyr52 में, आ RC-LH114-W में Ser5 से Tyr52 में कम कइल गइल। 3 या 4 एन-टर्मिनल या 13 सी-टर्मिनल अवशेष के कवनो घनत्व ना देखल गईल (चित्र S1)। जंगली प्रकार के तनाव से तैयार मिश्रित आरसी-एलएच1 परिसर के मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पता चलल कि गायब क्षेत्र एह पेप्टाइड सभ के हेटरोलॉजिकल क्लीवेज के परिणाम हवे (चित्र S1 आ S2)। α-Met1 के एन-टर्मिनल फॉर्मिलेशन भी देखल गइल (च)। विश्लेषण से पता चलल कि α-पेप्टाइड में अवशेष fMet1 से Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 होला, आ β-पेप्टाइड में अवशेष Ser2 से Ala53 होला, जवन कम तापमान के ईएम घनत्व के नक्शा से बढ़िया सहमति में बा।
α-His29 आ β-His36 के समन्वय से BChls के आमने-सामने बनावल जाला; हर αβ हेटरोडाइमर अपना पड़ोसी सभ के साथ एकट्ठा हो के आरसी के आसपास एगो खुला लूप (RC-LH114-W) या बंद लूप (RC-LH116) बनावे ला एक्साइटन युग्मित पिगमेंट सरणी (चित्र 1, C आ D)। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के 877 एनएम बैंड के तुलना में, आरसी-एलएच116 के 880 एनएम अवशोषण लाल शिफ्ट 3 एनएम बा (चित्र 2 ए)। हालाँकि, गोलाकार डाइक्रोइज्म स्पेक्ट्रम लगभग एकही नियर होला (चित्र 2B), ई बतावे ला कि हालाँकि, खुला आ बंद लूप सभ में साफ अंतर होला, बीसीएचएल सभ के स्थानीय वातावरण बहुत समान होला। सोखल रेडशिफ्ट बंद लूप (18, 19) पर तापीय गति में कमी आ बढ़ल स्थिरता के परिणाम हो सके ला, बंद लूप (20, 21) के कारण पिगमेंट कपलिंग में बदलाव, या एह दुनों परभाव सभ के संयोजन (11) हो सके ला।
(A) पराबैंगनी/दृश्यमान/नियर-इन्फ्रारेड अवशोषण स्पेक्ट्रम, जेकर चोटी सभ के उनके संबंधित पिगमेंट सभ से चिन्हित कइल जाला आ 775 एनएम पर बीपीएच चोटी पर सामान्य कइल जाला। (B) 805 एनएम पर BChl अवशोषण के लिए सामान्यीकृत गोलाकार द्विवर्णता स्पेक्ट्रम। (सी आ डी) आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (सी) आ आरसी-एलएच116 परिसर (डी) के समय-रिजोल्यूशन अवशोषण स्पेक्ट्रा से चुनल गइल ΔA स्पेक्ट्रा। बेहतर तुलनीयता खातिर, सभ स्पेक्ट्रा के 0.2 पीएस पर −A के ∆A तक सामान्य कइल जाला। (ई) UQ2 के विभिन्न सांद्रता के उपस्थिति में विकिरण के बाद साइटोक्रोम c2 ऑक्सीकरण की दर (कच्चा डेटा के लिए चित्र S8 देखें)। (F) कम, मध्यम या उच्च तीव्रता वाला प्रकाश (क्रमशः 10, 30 या 300μMm-2 s-1) के तहत उगावल कोशिका में, शुद्ध परिसर में प्रोटीन डब्ल्यू आ आरसी-एल सबयूनिट आ अलग झिल्ली अनुपात। एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस आ इम्यूनोएसे (कच्चा डेटा खातिर चित्र S9 देखल जाय) द्वारा प्रोटीन के स्तर के निर्धारण करीं। शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर के सापेक्ष अनुपात निर्धारित करें। परिसर के आरसी-एल आ प्रोटीन-डब्ल्यू के स्टोइकियोमेट्रिक अनुपात 1:1 होला।
RC-LH114-W (चित्र 1, ए, सी, आ ई) के विकृत αβ14 लूप में स्थिति 1 पर BChls आरसी-LH116 (चित्र 1, बी, डी, आ एफ, आ चित्र S3) में समकक्ष BChls के तुलना में 6.8Å आरसी प्राथमिक दाता (पी) के करीब बा; हालाँकि, दुनों परिसर सभ के क्षणिक सोखल गतिकी बतावे ले कि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू आ आरसी-एलएच116 खातिर, एलएच1 से आरसी तक के उत्तेजना ऊर्जा हस्तांतरण समय स्थिरांक 40 ±4 आ 44±3 पीएस होला (चित्र 2)। , सी अउर डी, चित्र S4 अउर तालिका S2)। आरसी के भीतर इलेक्ट्रॉनिक हस्तांतरण में भी कवनो खास अंतर नइखे (चित्र S5 आ संबंधित पूरक पाठ)। हमनी के संदेह बा कि LH1 आ RC-P के बीच ऊर्जा हस्तांतरण समय के करीबी पत्राचार दुनों LH1 लूप में अधिकतर BChl के समान दूरी, कोण आ संभावित ऊर्जा के कारण बा। अइसन बुझाला कि न्यूनतम दूरी तक पहुँचे खातिर LH1 ऊर्जा पैटर्न के खोज कइल सबऑप्टिमल साइट से आरसी में सीधा ऊर्जा हस्तांतरण से तेज ना होला। RC-LH114-W में खुला-लूप LH1 लूप संरचनात्मक बिस्लेषण खातिर कम तापमान के स्थिति में भी महत्वहीन तापीय गति से गुजर सके ला आ आरसी 1 के स्थिति पर βBChls के पिगमेंटेशन दूरी से कमरा के तापमान पर लंबा αβ14 रिंग कंफॉर्मेशन होला।
आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स में 32 बीसीएचएल आ 16 कैरोटीनॉयड होलें आ एकर समग्र ब्यवस्था थर्मोक्रोमैटियम (Tch.) पिडपिडम [प्रोटीन डाटा बैंक (PDB) आईडी 5Y5S] (9), थायोरोडोविब्रिओ (Trv.) 970 स्ट्रेन ( PDB ID 7C9R) (12) आ ग्रीन से मिलल ब्यवस्था नियर होला शैवाल (Blc.viridis) (पीडीबी आईडी 6ET5) (10) के बा। संरेखण के बाद, αβ हेटरोडाइमर के स्थिति में खाली छोट बिचलन देखल गइल, खासतौर पर 1-5, 15, आ 16 (चित्र S6)। प्रोटीन-डब्ल्यू के मौजूदगी के एलएच1 के संरचना पर काफी असर पड़ेला। एकर तीन गो टीएमएच छोट लूप से जुड़ल होलें, इनहन में एन-टर्मिनल कॉम्प्लेक्स के लुमेन साइड पर आ सी-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक साइड पर होला (चित्र 1A आ 3, A से D)। प्रोटीन-डब्ल्यू बहुत हद तक हाइड्रोफोबिक होला (चित्र 3 बी), आ TMH2 आ TMH3 LH1αβ-14 के साथ परस्पर क्रिया क के ट्रांसमेम्ब्रेन सतह बनावे लें (चित्र 3, बी आ ई से जी)। इंटरफेस मुख्य रूप से ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र में Phe, Leu आ Val अवशेष सभ से बनल होला। ई अवशेष हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड आ αβ-14 पिगमेंट सभ के साथ ढेर होलें। कुछ ध्रुवीय अवशेष भी एह परस्पर क्रिया में योगदान देलें, जवना में जटिल गुहा के सतह पर W-Thr68 आ β-Trp42 के बीच हाइड्रोजन बंधन भी सामिल बा (चित्र 3, F आ G)। कोशिका द्रव्य के सतह पर Gln34 αβ-14 कैरोटीनॉइड सभ के कीटो समूह से सटल होला। एकरे अलावा, n-डोडेसिल β-d-माल्टोसाइड (β-DDM) अणु के रिजोल्यूशन हो गइल आ एकर हाइड्रोफोबिक पूँछ प्रोटीन-W आ αβ-14 के बीच के इंटरफेस ले फइलल आ लिपिड पूँछ शरीर में स्थित हो सके ला। हमनी के इहो देखनी जा कि प्रोटीन डब्ल्यू अवुरी आरसीएच के सी-टर्मिनल रिजोल्यूशन क्षेत्र बहुत करीब बा, लेकिन विशिष्ट बातचीत बनावे के दायरा में नईखे (चित्र 1, ए अवुरी ई)। हालाँकि, एह दुनों प्रोटीन सभ के अनरिजोल्यूशन सी-टर्मिनल अमीनो एसिड सभ में परस्पर क्रिया हो सके ला, जे आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स के असेंबली के दौरान प्रोटीन-डब्ल्यू के भर्ती खातिर एगो तंत्र उपलब्ध करा सके ला।
(A) प्रोटीन-डब्ल्यू, जवन कार्टून के रूप में LH1αβ14 के साथ इंटरफेस के सामना करेला, रॉड के आकार के साइड चेन (लाल) होला, जवन इलेक्ट्रोस्टैटिक पोटेंशियल डायग्राम के एगो हिस्सा में प्रदर्शित होला (0.13 के समोच्च स्तर के साथ पारदर्शी ग्रे सतह)। (B) प्रोटीन-डब्ल्यू एक हाइड्रोफोबिक रंगीन सतह द्वारा प्रतिनिधित्व कइल जाला। ध्रुवीय आ आवेशित इलाका सभ के सियान में देखावल गइल बा, हाइड्रोफोबिक इलाका सभ के सफेद रंग में देखावल गइल बा आ मजबूती से हाइड्रोफोबिक इलाका सभ के नारंगी रंग में देखावल गइल बा। (C आ D) प्रोटीन-W के कार्टून में देखावल गइल, एकर ओरिएंटेशन (A) (C) में जइसन होला, आ 180° (D) से घुमावल जाला। अनुक्रम में स्थिति के अनुसार, बिभेद करे लायक अवशेष इंद्रधनुषी रंग योजना अपनावे लें, जहाँ एन-टर्मिनल नीला आ सी-टर्मिनल लाल होला। (E) प्रोटीन-डब्ल्यू (A) के समान दृष्टिकोण में, आ प्रोटीन-W:LH1 के इंटरफेस पर अवशेष के संलग्न निशान वाला रॉड से देखावल जाला। (F) प्रोटीन-डब्ल्यू कार्टून प्रतिनिधित्व में (E) आ LH1αβ14 के सापेक्ष 90° घुमावल जाला, आ बार प्रतिनिधित्व में इंटरफेस अवशेष के सापेक्ष। बीटा पॉलीपेप्टाइड से ओवरहैंगिंग अवशेष सभ के लेबल लगावल जाला। कोफैक्टर के चित्र 1 के रंग से मेल खाए वाला बार के रूप में देखावल गइल बा, सड़ल β-डीडीएम के ग्रे रंग में देखावल गइल बा आ ऑक्सीजन के लाल रंग में देखावल गइल बा। (G) (F) में दृश्य 180° घुमावल जाला, जवना में लेबल अल्फा पॉलीपेप्टाइड के प्रमुख अवशेष होला।
प्रोटीन-डब्ल्यू एगो αβ हेटरोडाइमर (चित्र 1F में 15वाँ) के जगह लेला, जेकरा से लूप बंद होखे आ पहिला तीन गो αβ हेटरोडाइमर सभ के झुकाव ना हो पावे ला। देखल गइल कि फिल्म सामान्य के सापेक्ष पहिला αβ-1 हेटरोडाइमर के अधिकतम झुकाव कोण 25° से 29° (चित्र 1, ए आ ई) रहे, जवन आरसी ए तेज कंट्रास्ट-LH116 (चित्र 1, बी आ एफ) में αβ-1 के 2° से 8° झुकाव से बनल रहे। दूसरा आ तीसरा हेटरोडाइमर क्रम से 12° से 22° आ 5° से 10° पर झुकल होला। आरसी के स्टेरिक बाधा के कारण, αβ-1 के झुकाव में αβ के दूसरा जोड़ी (जवन चित्र 1F में 16वां αβ से मेल खाला) शामिल ना होला, एह तरीका से LH1 रिंग में एगो साफ अंतराल बने ला (चित्र 1, ए आ ई)। दू गो αβ हेटरोडाइमर सभ के कमी के कारण, चार गो BChl आ दू गो कैरोटीनॉइड सभ के नुकसान के कारण, कौनों भी कैरोटीनॉयड मुड़ल αβ-1 सबयूनिट से ना जुड़ पावे ला, परिणामस्वरूप LH114-W रिंग बने ला जेह में 13 गो कैरोटीनॉइड शाकाहारी आ 28 गो BChls होलें। αβ1 से 7 क्षेत्र में दू गो परिसर सभ के स्थानीय रिजोल्यूशन अनुमान बाकी LH1 लूप के तुलना में कम होला, जवन आरसी क्यूबी साइट से सटल LH1 सबयूनिट के अंतर्निहित प्लास्टिसिटी के देखा सके ला (चित्र 4)।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू (ए आ बी) आ आरसी-एलएच116 (सी आ डी) के चित्र चित्र 1. (बी आ डी) के एकही ऊपरी दृश्य/साइड व्यू (ए आ बी) (ए आ सी) (ए आ सी) आ गुहा सतह से देखावल गइल बा। रंगीन कुंजी दाहिने ओर देखावल गइल बा।
1:14 के स्टोइकियोमेट्रिक अनुपात वाला एकलौता अउरी बिसेसता वाला कोर कॉम्प्लेक्स रोडोकोकस स्फेरोइड्स (Rba.) RC-LH1-PufX डाइमर (13) हवे। हालाँकि, प्रोटीन डब्ल्यू आ पफएक्स के कौनों स्पष्ट होमोलॉजी ना होला, आ इनहन के अपना-अपना एलएच1 संरचना पर काफी परभाव पड़े ला। PufX एगो एकल TMH हवे जेह में N-टर्मिनल साइटोप्लाज्मिक डोमेन होला जे RC-H सबयूनिट (13) के साइटोप्लाज्मिक साइड के साथ Rps के अनुरूप स्थिति पर बातचीत करे ला। पलुस्ट्रिस एलएच116αβ-16 के बा। PufX RC-LH1 आ साइटोक्रोम bcl कॉम्प्लेक्स के बीच क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज खातिर चैनल बनावे ला आ सभ Rba में मौजूद होला। स्फेरोइड्स कोर परिसर (13) के बा। हालांकि मोनोमर-मोनोमर इंटरफेस आरबीए में बा। स्फेरोइड्स RC-LH1-PufX डाइमर RC-LH114-W में प्रोटीन W के बाइंडिंग पोजीशन पर स्थित होला आ PufX आ प्रोटीन-W द्वारा पैदा होखे वाला गैप समकक्ष स्थिति पर होला (चित्र S7A)। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में अंतराल स्यूडोमोनास रोसिया एलएच1 के काल्पनिक क्विनोन चैनल (8) के साथ भी संरेखित होला, जवन प्रोटीन डब्ल्यू भा पफएक्स से संबंधित ना होखे वाला पेप्टाइड सभ से बनल होला (चित्र S7B)। एकरा अलावे बीएलसी में क्विनोन चैनल के बारे में बतावल गईल। एक γ सबयूनिट (7) के बाहर रख के बनल पन्ना हरे रंग के LH1 भी अइसने स्थिति में स्थित होला (चित्र S7C)। हालाँकि, अलग-अलग प्रोटीन सभ के माध्यम से होला, आरसी-एलएच1 कॉम्प्लेक्स में आम स्थिति में एह क्विनोन/क्विनोलोल चैनल सभ के रूप अभिसरण बिकास के उदाहरण के रूप में लउके ला, ई बतावे ला कि प्रोटीन डब्ल्यू द्वारा बनावल गइल अंतराल क्विनोन चैनल के रूप में काम क सके ला।
LH114-W लूप में अंतराल के कारण RC-LH114-W कॉम्प्लेक्स के अंदरूनी जगह आ थोक झिल्ली (चित्र 1G) के बीच लगातार झिल्ली क्षेत्र के निर्माण हो सके ला, ना कि प्रोटीन सभ नियर प्रोटीन छिद्र के माध्यम से दुनों डोमेन के जोड़े के। आरसी-एलएच116 परिसर बंद Tch के समान बा। सुई के तरह परिसर (22) (चित्र 1 एच)। चूँकि झिल्ली के माध्यम से क्विनोन के प्रसार संकरी प्रोटीन चैनल के माध्यम से प्रसार से तेज होला, खुला LH114-W लूप बंद LH116 लूप के तुलना में तेजी से आरसी टर्नओवर के अनुमति दे सके ला आ आरसी में क्विनोन के प्रसार ढेर प्रतिबंधित हो सके ला। ई परीक्षण करे खातिर कि प्रोटीन डब्ल्यू आरसी के माध्यम से क्विनोन के रूपांतरण के प्रभावित करेला कि ना, हमनी के यूबिक्विनोन 2 (UQ2) (छोट आइसोप्रीन पूंछ वाला प्राकृतिक UQ10 के एनालॉग) के एगो निश्चित एकाग्रता पर साइटोक्रोम ऑक्सीकरण परख कइनी जा (चित्र 2E)। हालांकि किलेटेड क्विनोन के मौजूदगी प्रतीत होखे वाला माइकेलिस स्थिरांक के सही निर्धारण में बाधा डालेले (RC-LH114-W आ RC-LH116 क्रमशः 0.2±0.1μM आ 0.5±0.2μM खातिर उपयुक्त बाड़ें), RC-LH114-W ( 4.6±0.2 e-RC-1 s-1) के अधिकतम दर बा आरसी-एलएच116 (3.6±0.1 ई-आरसी-1 एस-1) से 28±5% बड़ बा।
हमनी के शुरू में अनुमान लगावल कि प्रोटीन-डब्ल्यू कोर परिसर ( 16 ) के लगभग 10% में मौजूद बा; इहाँ, कम रोशनी वाला, मध्यम रोशनी वाला, आ उच्च रोशनी वाला बढ़ती कोशिका सभ के कब्जा दर क्रम से 15±0.6%, 11±1% आ 0.9±0.5 बा, % (चित्र 2F)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री के मात्रात्मक तुलना से पता चलल कि हिस्टिडीन टैग के जोड़े से जंगली प्रकार के उपजाति (P = 0.59) के तुलना में प्रोटीन-डब्ल्यू के सापेक्षिक बहुतायत में कमी ना आइल, एह से ई स्तर संशोधित प्रोटीन-डब्ल्यू के आर्टिफैक्ट ना हवें (चित्र S10)। हालाँकि, आरसी-एलएच1 कॉम्प्लेक्स में प्रोटीन-डब्ल्यू के ई कम कब्जा कुछ आरसी सभ के तेजी से फ्लिप करे के अनुमति दे सके ला, जेकरा से आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स में धीमा क्विनोन/क्विनोलोन एक्सचेंज के कम कइल जा सके ला। हमनी के देखनी जा कि उच्च प्रकाश कब्जा दर हाल के ट्रांसक्रिप्टोमिक्स डेटा के साथ असंगत बा, जवन बतावेला कि मजबूत प्रकाश के तहत pufW जीन अभिव्यक्ति बढ़ जाला (चित्र S11) (23)। RC-LH1 कॉम्प्लेक्स में pufW ट्रांसक्रिप्शन आ प्रोटीन-W के सामिल होखे के बीच के अंतर भ्रमित करे वाला बाटे आ ई प्रोटीन के कॉम्प्लेक्स रेगुलेशन के देखा सके ला।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में 6 गो कार्डियोलिपिन (सीडीएल), 7 गो फॉस्फेटिडाइलकोलाइन (पीओपीसी), 1 गो फॉस्फेटिडाइलग्लिसरॉल (पीओपीजी) आ 29 गो β-डीडीएम अणु सभ के आवंटन आ मॉडलिंग कइल जाला जेह में 6 गो सीडीएल, 24 गो पीओपीसी, 2 गो पीओपीजी आ 12 गो बीडीडीएम सभ के मॉडलिंग कइल जाला। आरसी-एलएच116 (चित्र 5, ए अउर बी)। एह दुनों संरचना सभ में सीडीएल लगभग कॉम्प्लेक्स के साइटोप्लाज्मिक साइड पर होला जबकि पीओपीसी, पीओपीजी आ β-डीडीएम ज्यादातर लुमिनल साइड पर होला। दू गो लिपिड आ डिटर्जेंट अणु के आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर (चित्र 5 ए) के αβ-1 से αβ-6 क्षेत्र में अलग कइल गइल, आ पांच गो आरसी-एलएच116 के समकक्ष क्षेत्र में अलग कइल गइल (चित्र 5 बी)। परिसर के दूसरा ओर, मुख्य रूप से सीडीएल, आरसी अवुरी αβ-7 से αβ-13 (चित्र 5, ए अवुरी बी) के बीच जमा भईल अवुरी लिपिड पावल गईल। अन्य संरचनात्मक रूप से रिजोल्यूशन लिपिड आ डिटर्जेंट सभ LH1 रिंग के बाहर स्थित होलें आ बढ़िया से रिजोल्यूशन कइल एसिली चेन सभ LH1 सबयूनिट सभ के बीच में फइलल होलीं, इनहन के अस्थायी रूप से RC-LH114-W में β-DDM के रूप में नाँव दिहल गइल बा आ आरसी β-DDM आ POPC-LH116 के मिश्रण में β-DDM के रूप में परिभाषित कइल गइल बा। हमनी के संरचना में किलेटिंग लिपिड आ डिटर्जेंट के समान स्थिति बतावेला कि ई शारीरिक रूप से प्रासंगिक बाइंडिंग साइट हवें (चित्र S12A)। Tch में समतुल्य अणु के स्थिति में भी बढ़िया स्थिरता होला। कोमल आ त्रव के बा। तनाव 970 आरसी-एलएच1s (चित्र S12, बी से ई) (9, 12) आ लिपिड हेड समूह के हाइड्रोजन-बॉन्डिंग अवशेष अनुक्रम संरेखण (चित्र S13) में काफी अच्छा संरक्षण देखवलस, ई बतावे ला कि संरक्षित सीडीएल जे आरसी (24) से जुड़ जाला, ई साइट आरसी-एलएच1 परिसर में संरक्षित हो सके लीं।
(A and B) RC-LH114-W (A) आ RC-LH116 (B) पेप्टाइड सभ के कार्टून से देखावल गइल बा, आ पिगमेंट सभ के रॉड से देखावल गइल बा, चित्र 1 में रंग योजना के इस्तेमाल से, लिपिड सभ के लाल रंग में देखावल गइल बा, आ डिटर्जेंट सभ के ग्रे रंग में देखावल गइल बा। आरसी क्यूए आ क्यूबी साइट से जुड़ल यूक्यू पीला रंग के होला जबकि अलग-थलग यूक्यू नीला रंग के होला। (C आ D) (A) आ (B) के समान विचार, लिपिड के छोड़ दिहल गइल बा। (ई से जी) आरसी-एलएच116 से क्यू 1 (ई), क्यू 2 (एफ) आ क्यू 3 (जी) के बढ़ल दृश्य, साइड चेन के साथ जे एक दुसरा के प्रभावित करे लीं। हाइड्रोजन बंधन के करिया डैश रेखा के रूप में देखावल गइल बा।
आरसी-एलएच116 में, आरसी क्यूए आ क्यूबी यूक्यू दुनों, जे चार्ज अलग करे के प्रक्रिया में इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर में भाग लेलें, अपना बाइंडिंग साइट में बिघटन हो जालें। हालांकि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में क्यूबी क्विनोन के हल नइखे भइल आ एकर विस्तार से चर्चा नीचे कइल जाई। क्यूए आ क्यूबी क्विनोन के अलावा, दू गो किलेटेड यूक्यू अणु (आरसी आ एलएच1 रिंग के बीच में स्थित) के आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना में उनके बढ़िया से रिजोल्यूशन हेड ग्रुप (क्रम से क्यू1 आ क्यू2 में स्थित) के अनुसार आवंटित कइल जाला। जगह)। चित्र 5 सी) के बा। दू गो आइसोप्रीन इकाई सभ के क्यू1 में सौंपल गइल बा आ घनत्व के नक्शा में क्यू2 के पूरा 10 गो आइसोप्रीन टेल सभ के रिजोल्यूशन कइल जाला। आरसी-एलएच116 के संरचना में, तीन गो किलेटेड UQ10 अणु (Q1 से Q3, चित्र 5D) के रिजोल्यूशन कइल गइल, आ सभ अणु सभ के पूरा पूंछ में साफ घनत्व होला (चित्र 5, D से G)। दुनों संरचना में, Q1 आ Q2 के क्विनोन हेड समूह के स्थिति में बेहतरीन स्थिरता होला (चित्र S12F), आ ई खाली आरसी के साथ बातचीत करे लें। Q1 RC-LH114-W के W गैप के प्रवेश द्वार पर स्थित बा (चित्र 1G आ 5, C, D आ E), आ Q2 QB बाइंडिंग साइट (चित्र 5, C, D) आ F के लगे स्थित बा। संरक्षित L-Trp143 आ L-Trp269 अवशेष Q1 आ Q2 के बहुत करीब होलें आ संभावित π-स्टैकिंग इंटरैक्शन (चित्र 5, E आ F, आ चित्र S12) प्रदान करे लें। L-Gln88, Q1 के डिस्टल ऑक्सीजन से 3.0 Å, एगो मजबूत हाइड्रोजन बंधन प्रदान करे ला (चित्र 5E); ई अवशेष सभसे दूर के संबंध के छोड़ के सभ आरसी सभ में संरक्षित होला (चित्र S13)। L-Ser91 ज्यादातर अन्य आरसी सभ में Thr के रूढ़िवादी रूप से प्रतिस्थापित होला (चित्र S13), Q1 के मिथाइल ऑक्सीजन से 3.8 एंगस्ट्रॉम होला, आ कमजोर हाइड्रोजन बंधन दे सके ला (चित्र 5E)। Q3 के कौनों बिसेस परस्पर क्रिया ना लउके ला, बलुक ई RC-M सबयूनिट आ LH1-α सबयूनिट 5 से 6 के बीच के हाइड्रोफोबिक इलाका में स्थित होला (चित्र 5, D आ G)। Q1, Q2 आ Q3 भा पास के किलेटेड क्विनोन सभ के भी Tch में रिजोल्यूशन कइल गइल बा। कोमल, त्रव के बा। तनाव 970 आ बीएलसी के बा। परितारिका संरचना (9, 10, 12) आरसी-एलएच1 परिसर (चित्र S12G) में एगो संरक्षित सहायक क्विनोन बाइंडिंग साइट के ओर इशारा करे ले। आरसी-एलएच116 में पांच विघटित यूक्यू उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा निर्धारित हर परिसर के 5.8±0.7 के साथ अच्छा सहमति में बा, जबकि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में तीन विघटित यूक्यू से कम बा The measured value of 6.2±0.3 (चित्र S14) बतावेला कि संरचना में अनसुलझल UQ अणु बा।
छद्म-सममित एल आ एम पॉलीपेप्टाइड सभ में हर एक में पाँच गो टीएमएच होलें आ एगो हेटरोडाइमर बने लें जे एक ठो बीसीएचएल डाइमर, दू गो बीसीएचएल मोनोमर, दू गो बैक्टीरियोफेज (बीपीएच) मोनोमर, आ एगो गैर-हीम आयरन आ एक या दू गो यूक्यू10 अणु सभ के मिला के बनावे ला। टर्मिनल कीटोन समूह पर हाइड्रोजन बंड के मौजूदगी आ आरपीएस में एकरे ज्ञात संचय के माध्यम से कैरोटीनॉइड सभ के एम-सबयूनिट में सामिल कइल जाला, जेकर नाँव सिस-3,4-डीहाइड्रोर्होडोपिन रखल जाला। प्रजाति (25) के बा। आरसी-एच के बाहरी झिल्ली डोमेन के झिल्ली से एकही टीएमएच द्वारा लंगर लगावल जाला। समग्र आरसी संरचना संबंधित प्रजाति (जइसे कि आरबीए) के तीन सबयूनिट आरसी नियर होला। स्फेरोइड्स (पीडीबी आईडी: 3I4D) के बा। BChl आ BPh के मैक्रोसाइकिल, कैरोटीनॉयड बैकबोन आ गैर-हीम आयरन एह संरचना सभ के रिजोल्यूशन रेंज के भीतर ओवरलैप होलें, जइसे कि क्यूए साइट पर यूक्यू10 हेड ग्रुप आ आरसी-एलएच116 पर क्यूबी क्विनोन (चित्र S15)।
अलग-अलग क्यूबी साइट कब्जा दर वाला दू गो आरसी संरचना सभ के उपलब्धता क्यूबी क्विनोन बाइंडिंग के साथ होखे वाला लगातार संरचनात्मक बदलाव सभ के जांच करे के एगो नया मौका देला। आरसी-एलएच116 परिसर में, क्यूबी क्विनोन पूरा तरीका से बाउंड "प्रोक्सिमल" स्थिति (26) में स्थित होला, बाकी आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के अलगाव में क्यूबी क्विनोन ना होला। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में क्यूबी क्विनोन ना होला, जवन आश्चर्यजनक बा काहें से कि ई कॉम्प्लेक्स सक्रिय होला, संरचनात्मक रूप से रिजोल्यूशन क्यूबी क्विनोन वाला आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स से ढेर। हालाँकि, दुनों LH1 रिंग लगभग छह गो क्विनोन के किलेट करे लीं, बंद RC-LH116 रिंग में पाँच गो संरचनात्मक रूप से रिजोल्यूशन होलें जबकि खुला RC-LH114-W रिंग में संरचनात्मक रूप से खाली तीन गो सीमित होलें। ई बढ़ल संरचनात्मक बिकार आरसी-एलएच114-डब्ल्यू क्यूबी साइट सभ के तेजी से बदले, परिसर में तेजी से क्विनोन गतिकी आ एलएच 1 लूप के पार करे के संभावना बढ़े के देखावे ला। हमनी के सुझाव बा कि आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के आरसी क्यूबी साइट में यूक्यू के कमी एगो अउरी जटिल आ अधिक सक्रिय परिसर के परिणाम हो सकेला, आ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के क्यूबी साइट यूक्यू टर्नओवर में तुरंत जम गइल बा विशिष्ट चरण (क्यूबी साइट के प्रवेश द्वार बंद हो गइल बा) एह गतिविधि के संरचना के दर्शावेला।
क्यूबी के बिना, L-Phe217 के साथ के घुमाव अइसन स्थिति में होला जे UQ10 बाइंडिंग के साथ असंगत होखे, काहें से कि ई पूंछ के पहिला आइसोप्रीन इकाई के साथ स्थानिक टक्कर पैदा करी (चित्र 6A)। एकरे अलावा, स्पष्ट मुख्य संरचनात्मक बदलाव स्पष्ट बा, खासतौर पर हेलिक्स डी (TMH D आ E के बीच के लूप में छोट हेलिक्स) जहाँ L-Phe217 के QB बाइंडिंग पॉकेट में शिफ्ट कइल जाला आ L-Tyr223 के घुमाव (चित्र 6A ) M-Asp45 फ्रेमवर्क के साथ हाइड्रोजन बंधन के तोड़े आ QB बाइंडिंग साइट के प्रवेश द्वार बंद करे खातिर (चित्र 6 बी) के बा। हेलिक्स अपना आधार पर डी पिवट होला, L-Ser209 के Cα 0.33Å शिफ्ट होला जबकि L-Val221Cα 3.52Å शिफ्ट होला। टीएमएच डी आ ई में कवनो निरीक्षण योग्य बदलाव ना होला, जवन दुनों संरचना में सुपरइम्पोजेबल होला (चित्र 6 ए)। जहाँ तक हमनी के जानकारी बा कि प्राकृतिक आरसी में इ पहिला संरचना ह जवन क्यूबी साइट के बंद क देवेला। पूरा (QB-बाउंड) संरचना के तुलना से पता चले ला कि क्विनोन के कम होखे से पहिले एकरा के क्विनोन में प्रवेश करे खातिर संरचनात्मक बदलाव के जरूरत होला। L-Phe217 घूम के क्विनोन हेड समूह के साथ π-स्टैकिंग इंटरैक्शन बनावे ला आ हेलिक्स बाहर के ओर शिफ्ट हो जाला जेवना से L-Gly222 के कंकाल आ L-Tyr223 के साइड चेन के स्थिर हाइड्रोजन बॉन्ड संरचना वाला हाइड्रोजन बॉन्ड नेटवर्क बनावे के इजाजत मिले ला (चित्र 6, A आ C)।
(A) होलोग्राम (एल चेन, ऑरेंज/एम चेन, मैजेंटा) आ एपो (ग्रे) संरचना के ओवरलैपिंग कार्टून, जवना में प्रमुख अवशेष सभ के रॉड नियर प्रतिनिधित्व के रूप में देखावल जाला। UQ10 के पीला रंग के बार से देखावल जाला। बिंदीदार रेखा पूरा संरचना में बनल हाइड्रोजन बंधन सभ के बतावे ले। (B आ C) एपोलिपोप्रोटीन आ पूरा रिंग संरचना के सतह के प्रतिनिधित्व, क्रमशः नीले रंग में L-Phe217 आ लाल रंग में L-Tyr223 के साइड चेन ऑक्सीजन के उजागर कइल। एल सबयूनिट नारंगी रंग के होला; एम आ एच सबयूनिट के रंग ना होला। (डी आ ई) एपोलिपोप्रोटीन (डी) आ पूरा (ई) आरसी क्यूबी साइट [क्रम से (ए) द्वारा रंग] आ थर्मोफिलस थर्मोफिलस पीएसआईआई (प्लास्टिक क्विनोन के साथ हरियर, नीला; पीडीबी आईडी: 3WU2) संरेखित करीं (58)।
अप्रत्याशित रूप से, हालाँकि, बिना एलएच1 के क्यूबी-कमी वाला आरसी सभ के कई गो संरचना उपलब्ध बाड़ी सऽ, एह अध्ययन में देखल गइल संरचनात्मक बदलाव के पहिले रिपोर्ट नइखे कइल गइल। एह में बीएलसी से क्यूबी डिप्लीशन स्ट्रक्चर शामिल बा। विरिडिस (पीडीबी आईडी: 3पीआरसी) (27), टीसीएच के बा। टेपिडम (पीडीबी आईडी: 1EYS) (28) आ आरबीए के नाम से जानल जाला। स्फेरोइड्स (PDB ID: 1OGV) (29), ई सभ लगभग उनके समग्र क्यूबी संरचना के समान होलें। 3PRC के करीबी निरीक्षण से पता चलल कि एलडीएओ (लॉरिल डाइमिथाइल अमाइन ऑक्साइड) डिटर्जेंट अणु क्यूबी पोजीशन के प्रवेश द्वार पर जुड़ जालें, जेकरा से बंद संरचना में फिर से व्यवस्थित होखे से रोकल जा सके ला। हालाँकि, 1EYS भा 1OGV में एलडीएओ एकही स्थिति में बिघट ना होला, ई आरसी सभ एकही डिटर्जेंट के इस्तेमाल से तइयार कइल जालें आ एह कारन एकही परभाव पैदा क सके लें। आरबीए के क्रिस्टल संरचना के बारे में बतावल गइल बा। साइटोक्रोम c2 (PDB ID: 1L9B) के साथ सह-क्रिस्टलाइज्ड स्फेरोइड्स आरसी में भी बंद क्यूबी साइट लउके ला। हालाँकि, एह मामला में, आरसी-एम पॉलीपेप्टाइड के एन-टर्मिनल क्षेत्र (क्यू हेलिक्स पर Tyr अवशेष के एच बंधन के माध्यम से क्यूबी बाइंडिंग साइट के साथ बातचीत करे वाला) एगो अप्राकृतिक संरचना अपनावे ला, आ क्यूबी संरचनात्मक बदलाव के अउरी खोज ना कइल जाला (30)। जवन बात आश्वस्त करे वाला बा उ इ कि हमनी के आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना में एम पॉलीपेप्टाइड के ए प्रकार के विरूपण नईखी देखले, जवन कि लगभग आरसी-एलएच116 आरसी के एन-टर्मिनल क्षेत्र के समान बा। इहो बतावल जाय कि डिटर्जेंट आधारित एलएच 1 एंटीना के उन्मूलन के बाद पीडीबी में एपोलिपोप्रोटीन आरसी सभ के हल हो गइल, जेकरा से आरसी आ आसपास के एलएच 1 रिंग के भीतरी सतह के बीच के अंतराल में आंतरिक क्विनोन पूल आ लिपिड सभ के खतम हो गइल (31, 32)। आरसी कामकाजी रहे ला काहें से कि ई सभ कोफैक्टर सभ के बरकरार रखे ला, सिवाय विघटन योग्य क्यूबी क्विनोन के, जवन कम स्थिर होला आ अक्सर तइयारी प्रक्रिया के दौरान खतम हो जाला ( 33 )। एकरे अलावा, ई जानल जाला कि आरसी से LH1 आ प्राकृतिक चक्रीय लिपिड सभ के हटावे से कामकाज पर परभाव पड़ सके ला, जइसे कि चार्ज से अलग कइल गइल P+QB-स्टेट के जीवनकाल कम होखल (31, 34, 35)। एह से हमनी के अनुमान बा कि आरसी के आसपास स्थानीय एलएच 1 रिंग के अस्तित्व से "बंद" क्यूबी साइट के बरकरार रखल जा सके ला, जेकरा से क्यूबी के लगे स्थानीय वातावरण के संरक्षण हो सके ला।
हालाँकि, एपोलिपोप्रोटीन (बिना क्यूबी क्विनोन के) आ पूरा संरचना क्यूबी साइट के टर्नओवर के खाली दू गो स्नैपशॉट के प्रतिनिधित्व करे ला, ना कि घटना सभ के सिलसिला के बजाय, अइसन संकेत बाड़ें कि हाइड्रोक्विनोन द्वारा रिबाइंडिंग के रोके खातिर बाइंडिंग के गेट कइल जा सके ला To inhibit substrate inhibition। एपोलिपोप्रोटीन के क्यूबी साइट के लगे क्विनोलोल आ क्विनोन के परस्पर क्रिया अलग हो सके ला, जेकरा चलते एकरा के आरसी द्वारा अस्वीकार कइल जाला। बहुत पहिले से ई प्रस्ताव कइल गइल बा कि संरचनात्मक बदलाव क्विनोन सभ के बाइंडिंग आ रिडक्शन में भूमिका निभावे ला। जमल आरसी सभ के डार्क एडैप्टेशन के बाद क्विनोन के कम करे के क्षमता बिगड़ जाला ( 36 ); एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी से पता चले ला कि ई नुकसान क्यूबी क्विनोन सभ के सक्रिय प्रोक्सिमल पोजीशन (26) , 37 से लगभग 4.5 Å के दूरी पर "डिस्टल" कंफॉर्मेशन में फंसल होखे के कारण होला। हमनी के सुझाव बा कि ई डिस्टल बाइंडिंग कंफॉर्मेशन एपोलिपोप्रोटीन आ पूरा रिंग संरचना के बीच के बिचालीन अवस्था के स्नैपशॉट हवे, जवन क्विनोन के साथ सुरुआती बातचीत आ क्यूबी साइट के खुले के बाद होला।
कुछ फोटोट्रोफिक बैक्टीरिया आ साइनोबैक्टीरिया, शैवाल आ पौधा सभ के पीएसआईआई कॉम्प्लेक्स में पावल जाए वाला टाइप II आरसी के संरचनात्मक आ कामकाजी संरक्षण होला ( 38 )। चित्र 6 (डी आ ई) में देखावल गइल संरचनात्मक संरेखण पीएसआईआई आरसी आ बैक्टीरियल आरसी परिसर के क्यूबी साइट के बीच के समानता पर जोर देला। ई तुलना बहुत पहिले से क्विनोन बाइंडिंग आ रिडक्शन के निकट संबंधित सिस्टम सभ के अध्ययन खातिर एगो मॉडल रहल बा। पिछला प्रकाशन सभ में सुझाव दिहल गइल कि संरचनात्मक बदलाव के साथ क्विनोन सभ के पीएसआईआई कमी भी होला ( 39 , 40 )। एह से आरसी के बिकासवादी संरक्षण के बिचार करत ई पहिले से ना देखल गइल बाइंडिंग तंत्र ऑक्सीजनयुक्त फोटोट्रोफिक पौधा सभ में पीएसआईआई आरसी के क्यूबी साइट पर भी लागू हो सके ला।
Rps ΔpufW (अनलेबल pufW डिलीशन) आ PufW-His (C-टर्मिनल 10x His-टैग कइल प्रोटीन-W प्राकृतिक pufW लोकस से एक्सप्रेस) उपजाति। palustris CGA009 के वर्णन हमनी के पिछला काम ( 16 ) में कइल गइल रहे। ई उपजाति आ आइसोजेनिक जंगली किसिम के माता-पिता के फ्रीजर से PYE (हर 5 ग्राम लीटर -1) (LB में -80 °C पर संग्रहीत, जवना में 50% ( w/v) ग्लिसरॉल) प्रोटीन, खमीर के अर्क आ सुसिनेट होखे) अगर [1.5% (w/v)] प्लेट पर थोड़ संख्या में कोशिका सभ के स्ट्रीकिंग क के बरामद कइल गइल। प्लेट के एनारोबिक परिस्थिति में कमरा के तापमान पर रात भर अन्हार में इन्क्यूबेट कइल गइल, आ फिर OSRAM 116-W हैलोजन बल्ब (RS Components, UK) द्वारा उपलब्ध करावल गइल सफेद रोशनी (~50 μmolm-2 s-1) से 3 से 5 दिन ले रोशन कइल गइल जबले कि एकही कॉलोनी ना लउकल। एकही कॉलोनी के इस्तेमाल 0.1% (w/v) कैसामिनो एसिड (अब से M22 कहल जाई) के पूरक 10 मिलीलीटर M22+ माध्यम (41) के टीकाकरण खातिर कइल गइल। संस्कृति के कम ऑक्सीजन के स्थिति में अन्हार में 34°C पर 180 आरपीएम पर 48 घंटा ले हिलावे के साथ उगावल गइल, आ फिर 70 मिलीलीटर संस्कृति के एही स्थिति में 24 घंटा ले टीका लगावल गइल। 1 मिलीलीटर के आयतन वाला सेमी-एरोबिक कल्चर के इस्तेमाल 30 मिलीलीटर यूनिवर्सल स्क्रू-टॉप पारदर्शी कांच के बोतल में 30 मिलीलीटर एम22 मीडियम के टीकाकरण करे खातिर कइल जाला आ बाँझ चुंबकीय बल से 48 घंटा ले हलचल (~50μmolm-2 s-1) से बिकिरणित कइल जाला। फिर 30 मिलीलीटर संस्कृति के लगभग 1 लीटर संस्कृति के साथ एही परिस्थिति में टीका लगावल गइल, जेकरा बाद लगभग 9 लीटर संस्कृति के टीकाकरण कइल गइल जे ~200 μmolm-2 s-1 पर 72 घंटा ले रोशन कइल गइल। कोशिका सभ के 7132 RCF पर 30 मिनट ले सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कटाई कइल गइल, ~10 मिलीलीटर 20 mM tris-HCl (pH 8.0) में फिर से लटका दिहल गइल, आ जरूरत के समय ले -20°C पर संग्रहीत कइल गइल।
पिघलला के बाद, फिर से लटकल कोशिका सभ में डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस I (मर्क, यूके), लाइसोजाइम (मर्क, यूके) आ दू गो रोश होलोएंजाइम प्रोटीज इनहिबिटर टैबलेट (मर्क, यूके) के कुछ क्रिस्टल डाल दीं। 20,000 पीएसआई के फ्रेंच प्रेशर सेल (अमिंको, अमेरिका) में कोशिका के 8 से 12 बेर बाधित कईल गईल। 4°C पर 18,500 RCF पर 15 मिनट ले सेंट्रीफ्यूजेशन से अटूट कोशिका आ अघुलनशील मलबा के हटावे के बाद, 43,000°C पर 2 घंटा ले 113,000 RCF पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा पिगमेंटेड लाइसेट से झिल्ली के अवक्षेपित कइल गइल। घुलनशील अंश के फेंक दीं आ रंगीन झिल्ली के 100 से 200 मिलीलीटर 20 mM ट्राइस-HCl (pH 8.0) में फिर से लटका दीं आ जबले कि कौनों समुच्चय ना लउके तब ले एकरूप बनाईं। निलंबित झिल्ली के 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) में 2% (w/v) β-DDM वाला 1 घंटा तक 4°C पर अंधेरे में धीरे से हलचल के साथ इन्क्यूबेट कइल गइल। फिर 70°C पर सेंट्रीफ्यूज करके 150,000 RCF के 4°C पर 1 घंटा तक घुल के अवशिष्ट अघुलनशील पदार्थ के हटा दिहल जाला।
ΔpufW तनाव से घुलनशील झिल्ली के 50 मिलीलीटर DEAE सेफारोज आयन एक्सचेंज कॉलम पर बाइंडिंग बफर के तीन कॉलम वॉल्यूम (CV) के साथ लगावल गइल [20 mM tris-HCl (pH 8.0) जवना में 0.03% (w / v) β-DDM] रहे। कॉलम के दू गो सीवी बाइंडिंग बफर से धोईं, आ ओकरा बाद कॉलम के दू गो बाइंडिंग बफर से धोईं जवना में 50 mM NaCl होखे। आरसी-एलएच116 परिसर के 1.75 सीवी पर 150 से 300 एमएम NaCl (बाइंडिंग बफर में) के रैखिक ढाल के साथ इल्यूट कइल गइल आ बाकी बाइंडिंग कॉम्प्लेक्स के 0.5 सीवी पर 300 mM NaCl वाला बाइंडिंग बफर से इल्यूट कइल गइल। 250 से 1000 एनएम के बीच सोख स्पेक्ट्रम एकट्ठा करीं, 880 से 280 एनएम पर 1 से ढेर सोखना अनुपात (A880/A280) वाला अंश के रखीं, बाइंडिंग बफर में दू बेर पतला करीं आ शुद्धिकरण पर DEAE कॉलम पर फिर से एही प्रक्रिया के इस्तेमाल करीं। 1.7 से अधिका A880/A280 अनुपात आ 3.0 से अधिका A880/A805 अनुपात वाला अंश सभ के पतला करीं, आयन एक्सचेंज के तीसरा दौर करीं आ 2.2 से ढेर A880/A280 अनुपात आ 5.0 से ढेर A880/A805 अनुपात वाला अंश सभ के बरकरार रखीं। आंशिक रूप से शुद्ध परिसर के एमिकॉन 100,000 आणविक भार कट-ऑफ (MWCO) केन्द्रापसारक फिल्टर (Merck, UK) में ~2 मिलीलीटर तक गाढ़ कइल गइल, आ सुपरडेक्स 200 16/600 साइज के बहिष्कार कॉलम (GE Healthcare, US) पर लोड कइल गइल जेह में 200 mM NaCl बफर रहे, आ फिर एही बफर में 1.5 CV पर इल्यूट कइल गइल। साइज एक्सक्लूजन फ्रैक्शन के सोखल स्पेक्ट्रा सभ के एकट्ठा करीं, आ 2.4 से ऊपर A880/A280 अनुपात आ 5.8 से 100 A880 से ऊपर A880/A805 अनुपात वाला सोखल स्पेक्ट्रा सभ के एकाग्र करीं, आ तुरंत एकर इस्तेमाल क्रायो-टीईएम ग्रिड तइयारी भा भंडारण खातिर करीं जबले जरूरत ना पड़े तबले -80°C पर रखीं।
PufW-His तनाव से घुलनशील झिल्ली के IMAC बफर ( GE Healthcare) में 20 मिलीलीटर HisPrep FF Ni-NTA Sepharose कॉलम (20 mM tris-HCl (pH 8.0) जवना में 200 mM NaCl आ 0.03% (w/w)) रहे) पर लगावल गइल। v) β-डीडीएम के बा]। कॉलम के पांच सीवी आईएमएसी बफर से धोवल गइल, आ ओकरा बाद पांच सीवी आईएमएसी बफर से धोवल गइल जवना में 10 एमएम हिस्टिडीन रहे। कोर कॉम्प्लेक्स के कॉलम से पांच आईएमएसी बफर से इल्यूट कइल गइल जवना में 100 एमएम हिस्टिडीन रहे। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू कॉम्प्लेक्स वाला अंश के एमिकॉन 100,000 मेगावाटको फिल्टर (मर्क, यूके) से लैस हलचल वाला टैंक में ~10 मिलीलीटर तक गाढ़ कइल जाला, बाइंडिंग बफर से 20 बेर पतला कइल जाला आ फिर 25 मिलीलीटर में मिलावल जाला डीईएई सेफारोज कॉलम में बफर से जुड़ल चार गो सीवी सभ के पहिले से इस्तेमाल कइल जाला। कॉलम के चार गो सीवी बाइंडिंग बफर से धोईं, फिर 0 से 100 mM NaCl (बाइंडिंग बफर में) के रैखिक ढाल पर आठ सीवी पर कॉम्प्लेक्स के इल्यूट करीं, आ बाकी चार गो सीवी सभ में 100 एमएम बाइंडिंग बफर होखे सोडियम क्लोराइड पर इल्यूट भइल अवशिष्ट परिसर सभ के 2.4 से ढेर A880/A280 अनुपात के साथ मिल के... 4.6 से ढेर अंश सभ के A880/A805 अनुपात के एमिकॉन 100,000 MWCO केन्द्रापसारक फिल्टर में ~2 मिलीलीटर ले गाढ़ कइल गइल, आ पहिले से 1.5 CV IMAC से भरल गइल बफर संतुलित सुपरडेक्स 200 16/600 साइज के बहिष्कार कॉलम, आ फिर 1.5 CV पर एही बफर में इल्यूट कइल गइल। साइज-बहिष्कार अंश सभ के सोखल स्पेक्ट्रा सभ के एकट्ठा करीं आ 2.1 से ढेर A880/A280 अनुपात आ 4.6 से 100 A880 से ढेर A880/A805 अनुपात वाला सोखल स्पेक्ट्रा सभ के एकाग्र करीं, जेकर इस्तेमाल तुरंत जमल TEM ग्रिड तइयारी खातिर कइल जाला या जरूरत तक ले -80°C पर संग्रहीत कइल जाला।
कम तापमान के टीईएम ग्रिड तैयार करे खातिर लीका ईएम जीपी इमर्सन फ्रीजर के इस्तेमाल कईल गईल। कॉम्प्लेक्स के आईएमएसी बफर में 50 के A880 तक पतला कइल गइल, आ फिर 5μl के नया ग्लो-डिस्चार्ज कइल गइल QUANTIFOIL 1.2/1.3 कार्बन-लेपित तांबा के जाली (Agar Scientific, UK) पर लोड कइल गइल। ग्रिड के 20°C आ 60% सापेक्षिक आर्द्रता पर 30 s ले इन्क्यूबेट करीं, फिर एकरा के 3 s ले सूखा के ब्लॉट करीं, आ फिर -176°C पर तरल ईथेन में बुझाईं।
आरसी-एलएच114-डब्ल्यू परिसर के डेटा के ईबीआईसी (इलेक्ट्रॉनिक बायोइमेजिंग सेंटर) (ब्रिटिश डायमंड लाइट सोर्स) पर टाइटन क्रिओस माइक्रोस्कोप से रिकार्ड कइल गइल, जवन 300kV के एक्सेलरेटिंग वोल्टेज पर काम करेला, जवना के नाममात्र के आवर्धन 130,000× आ ऊर्जा- 20 eV के अंतर चुनीं। डेटा एकट्ठा करे खातिर गिनती मोड में छवि रिकार्ड करे खातिर के2 पीक डिटेक्टर वाला गैटन 968 जीआईएफ क्वांटम के इस्तेमाल कइल गइल। कैलिब्रेटेड पिक्सेल के साइज 1.048Å बा, आ खुराक दर 3.83 e-Å-2s-1 बा। 11 सेकंड में सिनेमा के संग्रह क के 40 भाग में बांटल। माइक्रोस्कोप के फिर से फोकस करे खातिर कार्बन लेपित इलाका के इस्तेमाल करीं, आ ओकरा बाद प्रति छेद में तीन गो मूवी एकट्ठा करीं। कुल मिला के 3130 गो फिलिम सभ के एकट्ठा कइल गइल, जिनहन के डिफोकस मान -1 से -3μm के बीच रहल।
आरसी-एलएच116 परिसर खातिर डेटा एस्टरबरी बायोस्ट्रक्चर लैबोरेटरी (यूनिवर्सिटी ऑफ लीड्स, यूके) में एही माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल से एकट्ठा कइल गइल। डेटा के गिनती मोड में 130 k के आवर्धन के साथ एकट्ठा कइल गइल, आ पिक्सेल के साइज के 4.6 e-Å-2s-1 के खुराक के साथ 1.065 Å तक कैलिब्रेट कइल गइल। एह सिनेमा के रिकार्डिंग 12 सेकेंड में भइल आ एकरा के 48 भाग में बाँटल गइल. कुल मिला के 3359 फिलिम सभ के एकट्ठा कइल गइल, जिनहन के डिफोकस मान -1 से -3μm के बीच रहल।
सभ डेटा प्रोसेसिंग रिलियन 3.0 पाइपलाइन (42) में कइल जाला। खुराक भार से बीम गति के सही करे खातिर Motioncorr 2 (43) के इस्तेमाल करीं, आ ओकरा बाद CTF (कंट्रास्ट ट्रांसफर फंक्शन) पैरामीटर के निर्धारण करे खातिर CTFFIND 4.1 (44) के इस्तेमाल करीं। एह शुरुआती प्रोसेसिंग चरणन के बाद के ठेठ फोटोमाइक्रोग्राफ चित्र 2. S16 में देखावल गइल बा। स्वचालित चयन टेम्पलेट के निर्माण 250 पिक्सेल के फ्रेम में 1000 कण सभ के लगभग 250 पिक्सेल सभ के मैन्युअल रूप से चुन के कइल जाला आ कौनों संदर्भ द्वि-आयामी (2D) वर्गीकरण ना कइल जाला, एह तरीका से ओह वर्गीकरण सभ के नकार दिहल जाला जे नमूना दूषितता के पूरा करे लें या जिनहन में कौनों बूझल जाए वाला बिसेसता ना होखे। एकरे बाद, सभ माइक्रोफोटोग्राफ सभ पर ऑटोमैटिक चयन कइल गइल आ आरसी-एलएच114-डब्ल्यू में 849,359 कण रहलें, आ आरसी-एलएच116 कॉम्प्लेक्स में 476,547 कण रहलें। सभ चुनल कण सभ के गैर-संदर्भ 2D वर्गीकरण के दू गो दौर भइल बा आ हर रन के बाद, कार्बन क्षेत्र, नमूना दूषित होखे, कौनों स्पष्ट बिसेसता भा मजबूती से ओवरलैपिंग कण सभ के पूरा करे वाला कण सभ के खारिज कइल जाला, जेकरा परिणामस्वरूप 772,033 (90.9%) आ 359,678 (75.5%) ) कण सभ के इस्तेमाल 3D वर्गीकरण खातिर कइल जाला क्रमशः आरसी-एलएच114-डब्ल्यू आ आरसी-एलएच116 के नाम से जानल जाला। शुरुआती 3D संदर्भ मॉडल के निर्माण स्टोचैस्टिक ढाल वंश विधि के इस्तेमाल से कइल गइल। सुरुआती मॉडल के संदर्भ के रूप में इस्तेमाल से चुनल गइल कण सभ के 3D में चार श्रेणी में बाँटल जाला। एह श्रेणी के मॉडल के संदर्भ के रूप में इस्तेमाल करत, सभसे बड़ श्रेणी के कण सभ पर 3D रिफाइनिग करीं, फिर सॉल्वेंट एरिया के कवर करे खातिर सुरुआती 15Å लो-पास फिल्टर के इस्तेमाल करीं, 6 पिक्सेल के नरम किनारे जोड़ दीं, आ पिक्सेल सभ के पोस्ट-प्रोसेस क के टॉप डिटेक्टर के गैटन के2 पीक मॉड्यूलेशन ट्रांसफर फंक्शन के सही करीं। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू डाटासेट खातिर, मास्क के किनारे पर मजबूत घनत्व (यूसीएसएफ काइमेरा में कोर कॉम्प्लेक्स घनत्व से अलग) के हटा के एह सुरुआती मॉडल के संशोधित कइल गइल। परिणामस्वरूप मॉडल (RC-LH114-W आ RC-LH116 के रिजोल्यूशन क्रम से 3.91 आ 4.16 Å बा) के इस्तेमाल 3D वर्गीकरण के दूसरा दौर खातिर संदर्भ के रूप में कइल जाला। इस्तेमाल कइल गइल कण सभ के सुरुआती थ्रीडी क्लास में समूहबद्ध कइल जाला आ इनहन में पड़ोस के साथ मजबूत सहसंबंध ना होला। ओवरलैप भा स्पष्ट संरचनात्मक विशेषता के कमी। 3D वर्गीकरण के दूसरा दौर के बाद, सभसे ढेर रिजोल्यूशन वाला श्रेणी के चयन कइल गइल [RC-LH114-W खातिर, एक श्रेणी 377,703 कण (44.5%) बा, RC-LH116 खातिर, दू गो श्रेणी बाड़ी सऽ, कुल 260,752 कण (54.7%) , जहाँ ई सभ तबे एकही होलें जब सुरुआती घुमाव के बाद छोट अंतर के साथ संरेखित होखे लें]। चुनल कण सभ के 400 पिक्सेल के बॉक्स में फिर से निकालल जाला आ 3D रिफाइनिग से रिफाइंड कइल जाला। सॉल्वेंट मास्क के निर्माण सुरुआती 15Å लो-पास फिल्टर, 3 पिक्सेल मैप एक्सपेंशन आ 3 पिक्सेल सॉफ्ट मास्क के इस्तेमाल से कइल जाला। प्रति-कण सीटीएफ परिष्कार, प्रति-कण गति सुधार आ प्रति-कण सीटीएफ परिष्कार के दूसरा दौर के इस्तेमाल से, हर कदम के बाद 3D परिष्कार, विलायक मास्किंग आ पोस्ट-प्रोसेसिंग कइल जाला ताकि परिणामस्वरूप बनावट के अउरी परिष्कृत कइल जा सके। 0.143 के FSC (फूरियर शेल सहसंबंध गुणांक) कट-ऑफ मान के इस्तेमाल से, RC-LH114-W आ RC-LH116 के अंतिम मॉडल सभ के रिजोल्यूशन क्रम से 2.65 आ 2.80Å बा। अंतिम मॉडल के एफएससी वक्र चित्र 2. S17 में देखावल गइल बा।
सभ प्रोटीन अनुक्रम सभ के डाउनलोड कइल जाला UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); एलएच 1-α (पुफए; यूनिप्रोटआईडी: क्यू 6 एन 9 एल 4); आरसी-एल (पुएफएल; यूनिप्रोट आईडी: ओ83005) के रूप में इस्तेमाल कइल जाला; आरसी-एम (PufM; यूनिप्रोट आईडी: A0A4Z7) के रूप में; आरसी-एच (पुहए; यूनिप्रोट आईडी: ए0ए4जेड9) के बा; प्रोटीन-डब्ल्यू (PufW; यूनिप्रोट आईडी: Q6N1K3) के बा। SWISS-MODEL (45) के इस्तेमाल आरसी के होमोलॉजी मॉडल बनावे खातिर कइल गइल, जवना में आरसी-एल, आरसी-एम आ आरसी-एच के प्रोटीन अनुक्रम आ आरबीए के क्रिस्टल संरचना होला। sphaeroides आरसी के टेम्पलेट (पीडीबी आईडी: 5LSE) (46) के रूप में इस्तेमाल कइल गइल। यूसीएसएफ काइमेरा में “फिट मैप” टूल के इस्तेमाल से जनरेट कइल मॉडल के मैप (47) में फिट करीं, प्रोटीन संरचना में सुधार करीं, आ कोफैक्टर [4×BChl a (मोनोमर लाइब्रेरी अवशेष नाम = BCL), 2×BPh a (BPH), एक या दू तरह के UQ10 (U10), एक गैर-हीम आयरन (Fe) आ एक 3,4-डाइहाइड्रोहेक्साकार्बोनिल्कोलाइन (QAK)] जोड़े खातिर कूट (48) के इस्तेमाल करीं। चूँकि QAK मोनोमर लाइब्रेरी में उपलब्ध नइखे, एहसे एकरा के PHENIX (49) में eLBOW टूल के इस्तेमाल से पैरामीटराइज कइल गइल।
एकरा बाद एलएच 1 सबयूनिट के निर्माण कईल गईल। शुरू में, PHENIX (49) में स्वचालित निर्माण उपकरण के इस्तेमाल नक्शा आ इनपुट के रूप में LH1-α आ LH1-β प्रोटीन अनुक्रम के इस्तेमाल से LH1 अनुक्रम के कुछ हिस्सा के स्वचालित रूप से निर्माण करे खातिर कइल गइल। सबसे पूरा LH1 सबयूनिट के चयन करीं, ओकरा के निकाल के कूट में लोड करीं, मैन्युअल रूप से ओकरा में गायब अनुक्रम के जोड़ीं, आ दू गो BCls a (BCL) आ एगो स्पिरिलोक्सैन्थिन (CRT) के जोड़े से पहिले मैन्युअल रूप से पूरा संरचना के परिष्कृत करीं [सम्बंधित Rps के अनुसार LH1 कॉम्प्लेक्स के घनत्व आ ज्ञात कैरोटीनॉयड सामग्री। प्रजाति (17) के बा]। पूरा LH1 सबयूनिट के कॉपी करीं, आ LH1 घनत्व के बगल के गैर-मॉडल इलाका में डॉक करे खातिर UCSF काइमेरा “डॉकिंग मैप टूल” के इस्तेमाल करीं, आ फिर एकरा के कूट में रिफाइंड करीं; जब तक कि सभ LH1 सबयूनिट के मॉडलिंग ना हो जाव तब तक एह प्रक्रिया के दोहराईं। आरसी-एलएच114-डब्ल्यू संरचना खातिर, कूट में बिना आवंटित घनत्व के निकाल के, प्रोटीन के यूएससीएफ काइमेरा मैप में बाकी गैर-प्रोटीन घटक सभ से बिभाजन कइल जाला आ ऑटोबिल्ड टूल के इस्तेमाल सुरुआती मॉडल के स्थापना करे खातिर कइल जाला, आ बाकी सबयूनिट (प्रोटीन-डब्ल्यू) मॉडलिंग। फीनिक्स (49) में बा। कूट (48) में परिणामी मॉडल में कवनो गायब अनुक्रम के जोड़ीं, आ फिर पूरा सबयूनिट के मैन्युअल रूप से परिष्कृत करीं। बाकी बिना आवंटित घनत्व लिपिड (सीडीएल = सीडीएल, पीओपीसी = 6पीएल आ पीओपीजी = पीजीटी के पीडीबी मोनोमर लाइब्रेरी आईडी), बीटा-डीडीएम डिटर्जेंट (एलएमटी) आ यूक्यू10 अणु (यू10) के संयोजन में फिट होला। पूरा शुरुआती मॉडल के परफेक्ट करे खातिर कूट (48) में PHENIX ऑप्टिमाइजेशन (49) आ मैनुअल ऑप्टिमाइजेशन के इस्तेमाल करीं जबले कि मॉडल के आँकड़ा आ फिट के बिजुअल क्वालिटी में अउरी सुधार ना हो सके। अंत में, स्थानीय नक्शा के तेज करे खातिर LocScale (50) के इस्तेमाल करीं, आ फिर बिना आवंटित घनत्व के मॉडलिंग आ स्वचालित आ मैनुअल अनुकूलन के कई गो अउरी चक्र सभ के निष्पादन करीं।
अपना-अपना घनत्व के भीतर डॉक कइल गइल संबंधित पेप्टाइड, कोफैक्टर आ अन्य लिपिड आ क्विनोन सभ के चित्र 1 आ 2 में देखावल गइल बा S18 से S23। अंतिम मॉडल के सांख्यिकीय जानकारी तालिका S1 में देखावल गइल बा।
जबले कि अन्य तरीका से ना बतावल गइल होखे, यूवी/विस/एनआईआर सोख स्पेक्ट्रा सभ के कैरी60 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (एजिलेंट, अमेरिका) पर 250 एनएम से 1000 एनएम ले 1 एनएम के अंतराल पर आ 0.1s के एकीकरण समय पर एकट्ठा कइल गइल।
नमूना के क्वार्ट्ज क्यूवेट में पतला करीं जवना में 1 के A880 तक 2 मिमी के रास्ता होखे, आ 400 से 1000 एनएम के बीच सोखल स्पेक्ट्रम एकट्ठा करीं। गोलाकार डाइक्रोइक स्पेक्ट्रा सभ के जास्को 810 स्पेक्ट्रोपोलारिमीटर (जास्को, जापान) पर 400 एनएम से 950 एनएम के बीच 1 एनएम अंतराल पर 20 एनएम मिनट-1 के स्कैन दर पर एकट्ठा कइल गइल।
मोलर बिलुप्त होखे के गुणांक के निर्धारण कोर कॉम्प्लेक्स के लगभग 50 के A880 तक पतला क के कइल जाला।10μl वॉल्यूम के 990μl बाइंडिंग बफर भा मेथनॉल में पतला कइल जाला, आ BChl के गिरावट के कम से कम करे खातिर सोख स्पेक्ट्रम के तुरंत एकट्ठा कइल जाला। हर मेथनॉल नमूना के BChl सामग्री के गणना 54.8 एमएम-1 सेमी-1 के 771 एनएम पर विलुप्त होखे के गुणांक से कइल गइल, आ विलुप्त होखे के गुणांक के निर्धारण कइल गइल ( 51 )। नापल गइल BChl एकाग्रता के 32 (RC-LH114-W) या 36 (RC-LH116) से भाग के कोर कॉम्प्लेक्स एकाग्रता के निर्धारण करीं, जेकरा बाद बफर एक्सटिंक्शन गुणांक में एकट्ठा कइल गइल ओही नमूना के सोखल स्पेक्ट्रम के निर्धारण करे खातिर इस्तेमाल कइल जाला। समानांतर। हर नमूना खातिर तीन बेर बार-बार नापजोख कइल गइल, आ गणना खातिर BChl Qy अधिकतम के औसत सोखना के इस्तेमाल कइल गइल। 878 एनएम पर नापल गइल आरसी-एलएच114-डब्ल्यू के बिलुप्त होखे के गुणांक 3280±140 एमएम-1 सेमी-1 बाटे जबकि 880 एनएम पर नापल गइल आरसी-एलएच116 के बिलुप्त होखे के गुणांक 3800±30 एमएम-1 सेमी-1 बाटे।
UQ10 के मात्रा (52) में विधि के अनुसार कइल गइल। संक्षेप में कहल जाव त रिवर्स फेज एचपीएलसी (आरपी-एचपीएलसी) एजिलेंट 1200 एचपीएलसी सिस्टम के इस्तेमाल से कइल गइल। 0.02% (w/v) फेरिक क्लोराइड युक्त 50:50 मेथनॉल:क्लोरोफॉर्म के 50μl में RC-LH116 या RC-LH114-W के लगभग 0.02 nmol घोल दीं, आ पहिले से संतुलित बेकमैन कल्टर अल्ट्रास्फीयर ODS 4.6 mm के इंजेक्शन 1 ml-1 min-1 में 40°C में HPLC पर घोल दीं × 25 सेमी कॉलम पर विलायक (80:20 मेथनॉल: 2-प्रोपानोल)। एचपीएलसी विलायक में आइसोक्रेटिक इल्यूशन करीं ताकि 275 एनएम (UQ10), 450 एनएम (कैरोटीनॉयड) आ 780 एनएम (BChl) पर 1 घंटा तक अवशोषण के निगरानी कइल जा सके। 25.5 मिनट पर 275 एनएम क्रोमैटोग्राम में चोटी के एकीकृत कइल गइल, जवना में कवनो अउरी पता लगावे लायक यौगिक ना रहे। एकीकृत क्षेत्र के इस्तेमाल 0 से 5.8 एनएमओएल (चित्र S14) तक के शुद्ध मानक के इंजेक्शन से गणना कइल गइल कैलिब्रेशन वक्र के संदर्भ में निकालल गइल UQ10 के मोलर मात्रा के गणना करे खातिर कइल जाला। हर नमूना के तीन गो प्रतिलिपि में विश्लेषण कइल गइल, आ रिपोर्ट कइल गइल त्रुटि औसत के एसडी से मेल खाला।
0.1 के अधिकतम Qy अवशोषण वाला RC-LH1 कॉम्प्लेक्स वाला घोल के 30 μM रिड्यूस्ड हॉर्स हार्ट साइटोक्रोम c2 (मर्क, यूके) आ 0 से 50 μMUQ2 (मर्क, यूके) के साथ तइयार कइल गइल। हर UQ2 एकाग्रता पर तीन गो 1-एमएल नमूना तइयार कइल गइल आ रात भर 4°C पर अन्हार में इन्क्यूबेट कइल गइल ताकि माप से पहिले अन्हार में पूरा अनुकूलन सुनिश्चित कइल जा सके। घोल के ओलिस आरएसएम1000 मॉड्यूलर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में लोड कइल गइल जवन 300 एनएम के लौ/500 लाइन ग्रेटिंग, 1.24 मिमी इनलेट, 0.12 मिमी बीच आ 0.6 मिमी आउटलेट स्लिट से लैस रहे। नमूना फोटोट्यूब आ संदर्भ फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब के प्रवेश द्वार पर 600 एनएम लंबा पास फिल्टर लगावल जाला ताकि उत्तेजना प्रकाश के बाहर ना कइल जा सके। अवशोषण के निगरानी 550 एनएम पर 0.15 s के एकीकरण समय के साथ कइल गइल। उत्तेजना प्रकाश 880 एनएम M880F2 एलईडी (लाइट इमिटिंग डायोड) (Thorlabs Ltd., UK) से फाइबर ऑप्टिक केबल के माध्यम से 90% तीव्रता पर DC2200 नियंत्रक (Thorlabs Ltd., UK) के माध्यम से उत्सर्जित होला आ प्रकाश स्रोत पर 90° के कोण पर उत्सर्जित होला। नापजोख के बीम दर्पण के बिपरीत होला ताकि कौनों भी रोशनी वापस हो सके जे सुरुआत में नमूना द्वारा सोखल ना गइल होखे। 50 s के रोशनी से 10 s पहिले अवशोषण के निगरानी करीं। एकरे बाद अन्हार में 60 s ले सोखना के अउरी निगरानी कइल गइल ताकि ई आकलन कइल जा सके कि क्विनोलोल अनायास साइटोक्रोम c23 + के कतना कम क देला (कच्चा डेटा खातिर चित्र S8 देखल जाय)।
डेटा के प्रोसेसिंग 0.5 से 10 s के भीतर रेखीय प्रारंभिक दर (UQ2 एकाग्रता के आधार पर) फिट क के आ हर UQ2 एकाग्रता पर तीनों नमूना सभ के दर के औसत बना के कइल गइल। संबंधित बिलुप्त होखे के गुणांक द्वारा गणना कइल गइल आरसी-एलएच1 एकाग्रता के इस्तेमाल दर के उत्प्रेरक दक्षता में बदले खातिर कइल गइल, जेकरा के ओरिजिन प्रो 2019 (ओरिजिनलैब, अमेरिका) में प्लॉट कइल गइल, आ माइकेलिस-मेन्टेन मॉडल में फिट कइल गइल ताकि प्रतीत होखे वाला Km आ Kcat मान सभ के निर्धारण कइल जा सके।
क्षणिक अवशोषण माप खातिर, आरसी-एलएच1 नमूना के आईएमएसी बफर में ~2μM तक पतला कइल गइल जेह में 50 एमएम सोडियम एस्कॉर्बेट (मर्क, अमेरिका) आ 0.4 एमएम टर्बुटिन (मर्क, अमेरिका) रहे। एस्कॉर्बिक एसिड के इस्तेमाल बलिदान के इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कइल जाला आ टर्ट-ब्यूटाक्लोफेन के इस्तेमाल क्यूबी इनहिबिटर के रूप में कइल जाला ताकि ई सुनिश्चित कइल जा सके कि पूरा माप प्रक्रिया में मुख्य आरसी दाता कम होखे (अर्थात फोटोऑक्सीडाइज ना होखे)। लगभग 3 मिलीलीटर नमूना के कस्टम घूमे वाला सेल (लगभग 0.1 मीटर व्यास, 350 आरपीएम) में 2 मिमी ऑप्टिकल पथ लंबाई के साथ मिलावल जाला ताकि ई सुनिश्चित कइल जा सके कि लेजर पथ में नमूना के उत्तेजना नाड़ी सभ के बीच डार्क एडाप्टेशन खातिर पर्याप्त समय होखे। Ti: Sapphire लेजर सिस्टम (स्पेक्ट्रा फिजिक्स, अमेरिका) के एम्पलीफाई करे खातिर ~100-fs लेजर पल्स के इस्तेमाल करीं ताकि नमूना के 880 nm पर 1 kHz (NIR खातिर 20 nJ या Vis खातिर 100 nJ) के रिपीटेशन दर पर उत्तेजित कइल जा सके। डेटा एकट्ठा करे से पहिले नमूना के लगभग 30 मिनट तक उत्तेजना प्रकाश में राखीं। एक्सपोजर से क्यूए निष्क्रिय हो जाई (संभवतः एक-दू बेर क्यूए कम हो जाई)। बाकिर कृपया ध्यान दीं कि ई प्रक्रिया रिवर्सिबल बा काहे कि लंबा समय तक डार्क एडैप्टेशन के बाद आरसी धीरे-धीरे क्यूए एक्टिविटी में वापस आ जाई। -10 से 7000 पीएस के देरी समय के साथ क्षणिक स्पेक्ट्रा के नापे खातिर हेलियोस स्पेक्ट्रोमीटर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, अमेरिका) के इस्तेमाल कइल गइल। डेटा सेट सभ के अनग्रुप करे खातिर सरफेस एक्सप्लोरर सॉफ्टवेयर (अल्ट्राफास्ट सिस्टम्स, अमेरिका) के इस्तेमाल करीं, फिर मर्ज आ मानकीकरण करीं। क्षय से संबंधित डिफरेंसियल स्पेक्ट्रा हासिल करे खातिर संयुक्त डेटा सेट के इस्तेमाल करे खातिर कार्पेटव्यू सॉफ्टवेयर पैकेज (लाइट कन्वर्जन लिमिटेड, लिथुआनिया) के इस्तेमाल करीं, या फिर अइसन फंक्शन के इस्तेमाल करीं जे ओरिजिन (OriginLab, USA) में सिंगल-वेवलेंथ स्पेक्ट्रल बिकास के फिट करे खातिर इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस के साथ कई घातांक सभ के घुमावे ला।
जइसन कि ऊपर बतावल गइल बा (53), एगो प्रकाश संश्लेषण फिल्म तइयार कइल गइल जवना में एलएच1 कॉम्प्लेक्स होखे जवना में आरसी आ परिधीय एलएच2 एंटीना दुनों के कमी होखे। झिल्ली के 20 एमएम ट्राइस (पीएच 8.0) में पतला कइल गइल आ फिर 2 मिमी ऑप्टिकल पथ वाला क्वार्ट्ज क्यूवेट में लोड कइल गइल। नमूना के 540 एनएम पर उत्तेजित करे खातिर 30nJ लेजर पल्स के इस्तेमाल कइल गइल जवना के देरी समय -10 से 7000 पीएस रहे। डेटा सेट के प्रोसेस करीं जइसन कि आरपीएस खातिर वर्णित बा। पाल नमूना के बा।
झिल्ली के 150,000 RCF पर 4°C पर 2 घंटा ले सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली बनावल गइल, आ फिर 880 nm पर एकर सोखना के 20 mM tris-HCl (pH 8.0) आ 200 mM NaCl में फिर से लटका दिहल गइल। 4°C पर अंधेरे में 1 घंटा तक 2% (w/v) β-DDM में धीरे-धीरे हिला के झिल्ली के घोल दीं। नमूना के 100 मिमी ट्राइएथिल अमोनियम कार्बोनेट (पीएच 8.0) (TEAB; मर्क, यूके) में पतला क के 2.5 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 (बायो-रैड विश्लेषण) के प्रोटीन एकाग्रता तक ले पतला कइल गइल। आगे के प्रोसेसिंग पहिले प्रकाशित तरीका (54) से कइल गइल, 50 μg प्रोटीन के कुल 50 μl TEAB में पतला करे से शुरू कइल गइल जेह में 1% (w/v) सोडियम लॉरेट (Merck, UK) होखे। 60 एस के लिए sonication के बाद, यह 30 मिनट के लिए 37 ° C पर 5 एमएम tris (2-carboxyethyl) फॉस्फीन (Merck, ब्रिटेन) के साथ कम कर दिहल गइल। एस-एलकाइलेशन खातिर नमूना के 10 mM मिथाइल S-मिथाइलथियोमेथेनसल्फोनेट (Merck, UK) के साथ इन्क्यूबेट करीं आ 200 mM आइसोप्रोपानोल स्टॉक घोल से कमरा के तापमान पर 10 मिनट ले मिलावल जाय। प्रोटीओलाइटिक पाचन 2 μg ट्रिप्सिन/एंडोप्रोटीनेज Lys-C मिश्रण (Promega UK) मिला के कइल गइल आ 37°C पर 3 घंटा ले इन्क्यूबेट कइल गइल। लॉरेट सरफैक्टेंट के 50 μl एथिल एसीटेट आ 10 μl 10% (v/v) LC ग्रेड ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (TFA; थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) मिला के 60 s ले भंवर क के निकालल गइल। चरण पृथक्करण के 15,700 आरसीएफ पर 5 मिनट तक सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा बढ़ावा दिहल गइल। निर्माता के प्रोटोकॉल के मुताबिक, पेप्टाइड वाला निचला चरण के सावधानी से एस्पिरेट अवुरी डिसाल्ट करे खाती C18 स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) के इस्तेमाल कईल गईल। वैक्यूम सेंट्रीफ्यूजेशन से सुखावे के बाद नमूना के 0.5% TFA आ 3% एसीटोनिट्राइल में घोल दिहल गइल आ पहिले बिस्तार से बतावल गइल सिस्टम पैरामीटर सभ के इस्तेमाल से नैनोफ्लो आरपी क्रोमैटोग्राफी के साथ मिल के मास स्पेक्ट्रोमेट्री से 500 एनजी के बिस्लेषण कइल गइल।
आरपीएस के खोज करे खातिर प्रोटीन के पहचान आ मात्रा निर्धारण खातिर MaxQuant v.1.5.3.30 (56) के इस्तेमाल करीं। पलुस्ट्रिस प्रोटीओम डेटाबेस (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) पर दिहल गइल बा। मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीओमिक्स डेटा के डाटासेट आइडेंटिफायर PXD020402 के तहत PRIDE पार्टनर रिपोजिटरी (http://proteomecentral.proteomexchange.org) के माध्यम से प्रोटीओमएक्सचेंज एलायंस में जमा कइल गइल बा।
इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिल के आरपीएलसी द्वारा विश्लेषण खातिर, जंगली प्रकार के आरपीएस से आरसी-एलएच1 परिसर तैयार कइल गइल। पहिले प्रकाशित विधि (16) के उपयोग से, पैलुस्ट्रिस कोशिका में पैदा प्रोटीन एकाग्रता 20 मिमी हेपस (पीएच 7.8), 100 मिमी NaCl अवुरी 0.03% (w/v) β- (बायो-रैड विश्लेषण) ) डीडीएम में 2 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 रहे। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, 2D प्यूरिफिकेशन किट (GE Healthcare, USA) के इस्तेमाल से 10 μg प्रोटीन के अवक्षेपण तरीका से निकालल जाला, आ अवक्षेप के 20 μl 60% (v / v) फॉर्मिक एसिड (FA), 20% (v / v) एसीटोनिट्राइल आ 20% (v/v) पानी में घोल दिहल जाला। पांच माइक्रोलीटर के विश्लेषण आरपीएलसी (डायोनेक्स आरएसएलसी) द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (मैक्सिस यूएचआर-टीओएफ, ब्रूकर) के साथ जोड़ा कइल गइल। 60°C आ 100μlmin -1 पर अलग करे खातिर MabPac 1.2×100 mm कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) के इस्तेमाल करीं, जवना में 85% (v / v) विलायक A [0.1% (v / v) FA आ 0.02% (V/v) TFA जलीय घोल] से 85%(v/v) विलायक B के ढाल होखे [90%(v/v) FA आ 90%(v/v) एसीटोनिट्राइल TFA में 0.02%(v/v)] मानक इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण स्रोत आ 60 मिनट से ढेर समय ले डिफ़ॉल्ट पैरामीटर सभ के इस्तेमाल से, मास स्पेक्ट्रोमीटर 100 से 2750 m/z (मास-टू-चार्ज अनुपात) प्राप्त करे ला। ExPASy बायोइन्फोर्मैटिक्स रिसोर्स पोर्टल FindPept टूल (https://web.expasy.org/findpept/) के मदद से, मास स्पेक्ट्रम के कॉम्प्लेक्स के सबयूनिट सभ के मैप करीं।
कोशिका के 100 मिलीलीटर एनएफ-कम (10μMm-2 s-1), मध्यम (30μMm-2 s-1) या उच्च (300μMm-2 s-1) प्रकाश के तहत 72 घंटा तक बढ़ावल गईल। M22 मीडियम (M22 मीडियम जवना में अमोनियम सल्फेट के छोड़ दिहल जाला आ सोडियम सुसिनेट के जगह सोडियम एसीटेट दिहल जाला) के 100 मिलीलीटर के स्क्रू-टॉप बोतल (23) में डाल दिहल जाला। पांच 30-s चक्र में, 0.1 माइक्रोन ग्लास बीड्स के 1:1 के वॉल्यूम रेशियो पर बीड कइल गइल ताकि कोशिका सभ के लाइस कइल जा सके आ बर्फ पर 5 मिनट ले ठंडा कइल गइल। अघुलनशील पदार्थ, अटूट कोशिका आ कांच के बीड्स के बेंचटॉप माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में 16,000 आरसीएफ पर 10 मिनट खातिर सेंट्रीफ्यूजेशन से हटा दिहल गइल। झिल्ली के 40/15% (w/w) सुक्रोज ढाल के साथ 20 mM tris-HCl (pH 8.0) में 100,000 RCF के साथ Ti 70.1 रोटर में 10 घंटा तक अलग कइल गइल।
जइसन कि हमनी के पिछला काम में बतावल गइल बा, PufW (16) पर His टैग के इम्यूनोडिटेक्शन। संक्षेप में, शुद्ध कोर कॉम्प्लेक्स (11.8 एनएम) या 2x एसडीएस लोडिंग बफर (मर्क, यूके) में आरसी के एकही एकाग्रता वाला झिल्ली (कम भइल अंतर स्पेक्ट्रम के घटाव के ऑक्सीकरण से निर्धारित कइल जाला आ दागदार जेल पर लोड के मिलान कइल जाला) के दू बेर पतला कइल गइल। प्रोटीन सभ के प्रतिकृति 12% बिस्-ट्रिस नुपेज जेल (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) पर अलग कइल गइल। आरसी-एल सबयूनिट के लोड आ विजुअलाइज करे खातिर एगो जेल के कूमासी ब्रिलियंट ब्लू (बायो-रैड, यूके) से रंगल गइल। दूसरा जेल पर मौजूद प्रोटीन के इम्यूनोएसे खातिर मेथनॉल-सक्रिय पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली (थर्मो फिशर साइंटिफिक, यूके) में स्थानांतरित कइल गइल। पीवीडीएफ झिल्ली के 50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.6), 150 एमएम NaCl, 0.2% (v / v) ट्वीन-20 आ 5% (w / v) स्किम्ड दूध पाउडर में ब्लॉक कइल गइल, आ फिर एंटी-हिस प्राथमिक एंटीबॉडी (में पतला एंटीबॉडी बफर [50 एमएम ट्राइस-एचसीएल (पीएच 7.6) में) के साथ इनक्यूबेट कइल गइल। 150 mM NaCl आ 0.05% (v/v) Tween-20] के 1:1000 A190-114A, बेथाइल लैबोरेटरीज, अमेरिका) में 4 घंटा तक डालल जाला। एंटीबॉडी बफर में 5 मिनट तक 3 बेर धोवे के बाद, झिल्ली के हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (सिग्मा-एल्ड्रिच, यूके) एंटी-माउस सेकेंडरी एंटीबॉडी (एंटीबॉडी बफर में 1:10,000 पतला कइल) के साथ मिलावल गइल ताकि पता लगावे के अनुमति मिल सके (एंटीबॉडी बफर में 3 बेर धोवे के बाद 5 मिनट बाद) WESTAR ETA C 2.0 केमिलुमिनसेंस सब्सट्रेट के इस्तेमाल से (सियानाजेन, इटली) आ अमेरशम इमेजर 600 (जीई हेल्थकेयर, यूके) के इस्तेमाल कइल जाला।
हर रंगीन जेल या इम्यूनोएसे लेन के तीव्रता वितरण के खींच के, चोटी के नीचे क्षेत्र के एकीकृत करके आ आरसी-एल (रंग वाला जेल) आ प्रोटीन-डब्ल्यू (इम्यूनोएसे) के तीव्रता अनुपात के गणना करके, इमेजजे (57) में छवि के प्रक्रिया करीं। एह अनुपात सभ के मोलर अनुपात में बदल दिहल गइल ई मान के कि शुद्ध आरसी-एलएच114-डब्ल्यू नमूना में आरसी-एल आ प्रोटीन-डब्ल्यू के अनुपात 1:1 बा आ एकरे अनुसार पूरा डेटा सेट के सामान्य कइल गइल।
एह लेख खातिर पूरक सामग्री खातिर, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 देखल जाय
ई एगो खुला पहुँच वाला लेख हवे जे क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन लाइसेंस के शर्त के तहत बितरित कइल गइल बा। लेख में कवनो भी माध्यम में अप्रतिबंधित इस्तेमाल, बितरण आ पुनरुत्पादन के अनुमति दिहल गइल बा, एह शर्त पर कि मूल रचना के सही उद्धरण दिहल गइल होखे।
नोट: हमनी के रउआँ से खाली आपन ईमेल पता देवे के कहत बानी जा ताकि जवना आदमी के रउआँ पन्ना पर सिफारिश कइले बानी ऊ जान जाव कि रउआँ चाहत बानी कि ऊ ईमेल देखे आ ई स्पैम ना ह। हमनी के कवनो ईमेल पता के कैप्चर ना करब जा।
एह सवाल के इस्तेमाल एह बात के परीक्षण करे खातिर कइल जाला कि रउरा विजिटर हईं कि ना आ स्वचालित स्पैम सबमिशन रोके खातिर.
डेविड जे के स्वैंसबरी, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम. फारीज़, डारियस एम निएडज़्विएज़की, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, लोर्ना ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए रैंसन, डेनियल पी कैनिफ , मार्क जे डिकमैन, डेवी होल्टेन, क्रिस्टीन किरमैयर, एंड्रयू हिचकॉक, सी नील हंटर
रिएक्शन सेंटर में लाइट ट्रैप 1 कॉम्प्लेक्स के हाई-रिजोल्यूशन संरचना क्विनोन डायनामिक्स के नया जानकारी देला।
डेविड जे के स्वैंसबरी, पार्क कियान, फिलिप जे जैक्सन, कैटलिन एम. फारीज़, डारियस एम निएडज़्विएज़की, एलिजाबेथ सी मार्टिन, डेविड ए किसान, लोर्ना ए मेलोन, रेबेका एफ थॉम्पसन, नील ए रैंसन, डेनियल पी कैनिफ , मार्क जे डिकमैन, डेवी होल्टेन, क्रिस्टीन किरमैयर, एंड्रयू हिचकॉक, सी नील हंटर
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