वर्तमान *वर्तमान पता: कोलोन 50931, जर्मनी, कोलोन एक्सीलेंस क्लस्टर रिसर्च ऑन सेलुलर तनाव रिस्पांस इन एजिंग-रिलेटेड डिजीज (सीईसीएडी)।
माइटोकॉन्ड्रिया के बेमारी सभ के न्यूरोडिजनरेशन के अपरिवर्तनीय मानल जाला काहें से कि न्यूरॉन सभ के मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी सीमित होले, बाकी शरीर में न्यूरॉनल मेटाबोलिज्म के कोशिका स्वायत्तता पर माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के परभाव के बारे में बहुत कम जानकारी बाटे। इहाँ, हमनी के बाधित माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूजन डायनामिक्स के कारण प्रगतिशील ऑक्सफोस कमी वाला पुर्किन्जे न्यूरॉन्स के कोशिका-विशिष्ट प्रोटीओम के परिचय देत बानी जा। हमनी के पाता चलल कि माइटोकॉन्ड्रिया के विकार प्रोटीओमिक्स के क्षेत्र में गहिराह बदलाव के ट्रिगर कईलस, जवना के चलते अंत में कोशिका के मौत से पहिले सटीक चयापचय कार्यक्रम के क्रमिक सक्रियता हो गईल। अप्रत्याशित रूप से, हमनी के पाइरुवेट कार्बोक्जिलेज (पीसीएक्स) अवुरी टीसीए चक्र मध्यवर्ती के पूरक से संबंधित अन्य पेरोक्साइडेज के स्पष्ट प्रेरण निर्धारित कईनी। पीसीएक्स के रोकथाम से ऑक्सीडेटिव तनाव आ न्यूरोडिजनरेशन बढ़ गइल, ई बतावे ला कि ऑक्सफोस के कमी वाला न्यूरॉन सभ में धमनीकाठिन्य के सुरक्षात्मक प्रभाव होला। अंतिम रूप से क्षयग्रस्त न्यूरॉन सभ में माइटोकॉन्ड्रिया फ्यूजन के बहाली एह मेटाबोलिक बिसेसता सभ के पूरा तरीका से उलट देला, जेकरा से कोशिका के मौत ना हो पावे ला। हमनी के खोज से पहिले से अज्ञात रास्ता के पहचान कईल गईल बा, जवन कि माइटोकॉन्ड्रिया के विकार के लचीलापन देवेला अवुरी बतावता कि बेमारी के अंतिम दौर में भी न्यूरोडिजनरेशन के उलट दिहल जा सकता।
न्यूरॉनल ऊर्जा चयापचय के बनावे रखे में माइटोकॉन्ड्रिया के केंद्रीय भूमिका पर मानव माइटोकॉन्ड्रिया के बेमारी सभ से जुड़ल व्यापक न्यूरोलॉजिकल लच्छन सभ के जोर दिहल जाला। एह में से ज्यादातर बेमारी सभ जीन उत्परिवर्तन के कारण होखे लीं जे माइटोकॉन्ड्रिया जीन एक्सप्रेशन (1, 2) भा माइटोकॉन्ड्रिया डायनामिक्स से संबंधित जीन के बिनाश के नियंत्रित करे लीं, जवन माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए (mtDNA) के स्थिरता के अप्रत्यक्ष रूप से प्रभावित करे ला (3, 4)। जानवरन के मॉडल में काम से पता चलल बा कि आसपास के ऊतक सभ में माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के जवाब में, रूढ़िवादी मेटाबोलिक रास्ता (5-7) सभ के सक्रिय कइल जा सके ला, एह तरीका से एह जटिल बेमारी सभ के रोगजनन के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी मिल सके ला। एकरा एकदम विपरीत, दिमाग के माइटोकॉन्ड्रिया एडेनोसाइने ट्राइफॉस्फेट (ATP) उत्पादन के सामान्य विफलता के कारण विशिष्ट कोशिका प्रकार के चयापचय परिवर्तन के बारे में हमनी के समझ मौलिक बा (8), जवना में चिकित्सीय लक्ष्य के पहचान करे के जरूरत प जोर दिहल गईल बा, जवना के इस्तेमाल बेमारी के रोके चाहे रोके खाती कईल जा सकता। न्यूरोडिजनरेशन (9) के रोके के बा। जानकारी के कमी ई तथ्य बा कि तंत्रिका कोशिका सभ के आसपास के ऊतक सभ के कोशिका प्रकार सभ के तुलना में बहुत सीमित मेटाबोलिक लचीलापन मानल जाला ( 10 )। ई देखत कि ई कोशिका सभ सिनैप्टिक संचरण के बढ़ावा देवे आ चोट आ बेमारी के स्थिति सभ के प्रतिक्रिया देवे खातिर न्यूरॉन सभ के मेटाबोलाइट्स के आपूर्ति के समन्वय में केंद्रीय भूमिका निभावे लीं, मस्तिष्क के ऊतक के चुनौतीपूर्ण स्थिति सभ में कोशिका मेटाबोलिज्म के अनुकूलित करे के क्षमता लगभग ग्लिया कोशिका सभ ले सीमित बा ( 11-14 )। एकरे अलावा, दिमाग के ऊतक सभ के निहित कोशिका बिसमरूपता बहुत हद तक चयापचय के बदलाव के अध्ययन में बाधा पैदा करे ले जे बिसेस न्यूरॉनल उपसमूह सभ में होखे लें। एकरे परिणाम के रूप में न्यूरॉन सभ में माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के सटीक कोशिका आ चयापचय के परिणाम के बारे में बहुत कम जानकारी बा।
माइटोकॉन्ड्रिया के विकार के चयापचय के परिणाम के समझे खातिर हमनी के माइटोकॉन्ड्रिया के बाहरी झिल्ली संलयन (Mfn2) के विनाश के कारण न्यूरोडिजनरेशन के अलग-अलग चरण में पुर्किन्जे न्यूरॉन (पीएन) के अलग कईनी। हालाँकि, मनुष्य में Mfn2 उत्परिवर्तन वंशानुगत मोटर संवेदी न्यूरोपैथी के एगो रूप से जुड़ल होला जेकरा के चारकोट-मैरी-टूथ टाइप 2A (15) के नाँव से जानल जाला, चूहा सभ में Mfn2 के सशर्त विनाश ऑक्सीकरण फॉस्फोरिलेशन (OXPHOS) डिसफंक्शन तरीका के एगो सुप्रसिद्ध इंडक्शन हवे। बिबिध न्यूरॉनल उपप्रकार (16-19) आ एकरे परिणामस्वरूप न्यूरोडिजनरेटिव फेनोटाइप के साथ प्रगतिशील न्यूरोलॉजिकल लच्छन भी होलें, जइसे कि मूवमेंट डिसऑर्डर (18, 19) भा सेरिबेलर अटैक्सिया (16)। लेबल-फ्री क्वांटैटिव (LFQ) प्रोटीओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स, इमेजिंग, आ वायरलॉजिकल तरीका सभ के संयोजन के इस्तेमाल से हमनी के ई देखावे के बा कि प्रगतिशील न्यूरोडिजनरेशन पाइरुवेट कार्बोक्जिलेज (PCx) आ अउरी कारक सभ के मजबूती से पैदा करे ला जे इन विवो में पीएन सभ के धमनीकाठिन्य में शामिल बाड़ें एंजाइम सभ के अभिव्यक्ति। एह खोज के प्रासंगिकता के सत्यापन करे खातिर हमनी के विशेष रूप से Mfn2 के कमी वाला पीएन में PCx के अभिव्यक्ति के डाउन-रेगुलेट कइनी जा, आ पावल गइल कि ई ऑपरेशन ऑक्सीडेटिव तनाव के बढ़ावेला आ न्यूरोडिजनरेशन में तेजी ले आवेला, एह तरह से साबित भइल कि एजोस्पर्मिया कोशिका के मौत के चयापचय अनुकूलन क्षमता प्रदान करेला। MFN2 के गंभीर एक्सप्रेशन से गंभीर ऑक्सफोस के कमी, माइटोकॉन्ड्रिया डीएनए के भारी खपत, आ प्रतीत होखे वाला टूटल माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क के साथ टर्मिनल डिजनरेशन पीएन के पूरा तरीका से बचावल जा सके ला, ई अउरी एह बात पर जोर देला कि न्यूरोडिजनरेशन के ई रूप कोशिका के मउअत से पहिले बेमारी के उन्नत अवस्था में भी ठीक हो सके ला।
Mfn2 नॉकआउट पीएन में माइटोकॉन्ड्रिया के कल्पना करे खातिर, हमनी के एगो माउस तनाव के इस्तेमाल कईनी जा जवन Cre-निर्भर माइटोकॉन्ड्रिया के पीला फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP) (mtYFP) (20) Cre अभिव्यक्ति के निशाना बनावे के अनुमति देला अवुरी विवो में माइटोकॉन्ड्रिया के आकृति विज्ञान के जांच कईनी। हमनी के पाता चलल कि पीएन में Mfn2 जीन के विनाश से माइटोकॉन्ड्रिया नेटवर्क के धीरे-धीरे विभाजन होई (चित्र S1A), अवुरी सबसे जल्दी बदलाव 3 सप्ताह के उमर में पावल गईल। एकरे बिपरीत, पीएन कोशिका परत के पर्याप्त क्षय, जेकर प्रमाण कैलबिंडिन इम्यूनोस्टेनिंग के नुकसान से मिले ला, 12 हप्ता के उमिर ले शुरू ना भइल (चित्र 1, ए आ बी)। माइटोकॉन्ड्रिया के आकृति विज्ञान में सबसे शुरुआती बदलाव अवुरी न्यूरॉनल मौत के लउके वाला शुरुआत के बीच के समय के बेमेल हमनी के कोशिका के मौत से पहिले माइटोकॉन्ड्रिया के विकार से शुरू होखेवाला मेटाबोलिक बदलाव के जांच करे खाती प्रेरित कईलस। हमनी के YFP (YFP +)-अभिव्यक्त पीएन (चित्र 1C) के अलग करे खातिर एगो फ्लोरोसेंस-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) आधारित रणनीति विकसित कइनी जा, आ नियंत्रण चूहा (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) में, जेकरा के आगे CTRL (चित्र S1B) के रूप में संदर्भित कइल जाई। YFP सिग्नल के सापेक्षिक तीव्रता के आधार पर गेटिंग रणनीति के अनुकूलन हमनी के गैर-पीएन (YFPneg) (चित्र S1B) या कथित फ्लोरोसेंट एक्सोन / डेंड्रिटिक टुकड़ा (YFPlow; चित्र S1D, बाईं ओर), कॉनफोकल माइक्रोस्कोप (चित्र S1D, दाहिने) से पीएन के YFP + शरीर (YFPhigh) के शुद्ध करे के अनुमति देला। वर्गीकृत आबादी के पहचान के सत्यापन करे खातिर, हमनी के LFQ प्रोटीओमिक्स अवुरी ओकरा बाद प्रिंसिपल घटक विश्लेषण कईनी, अवुरी पाता चलल कि YFPhigh अवुरी YFPneg कोशिका के बीच स्पष्ट अलगाव बा (चित्र S1C)। YFPhigh कोशिका सभ में ज्ञात पीएनएस मार्कर (यानी Calb1, Pcp2, Grid2 आ Itpr3) (21, 22) के शुद्ध संवर्धन देखल गइल, बाकी आमतौर पर न्यूरॉन भा अन्य कोशिका प्रकार सभ में व्यक्त प्रोटीन सभ के कौनों संवर्धन ना देखल गइल (चित्र 1D))। स्वतंत्र प्रयोग में एकट्ठा कइल गइल वर्गीकृत YFPhigh कोशिका सभ में नमूना सभ के बीच के तुलना में सहसंबंध गुणांक> 0.9 देखल गइल, ई जैविक प्रतिकृति सभ के बीच बढ़िया प्रजनन क्षमता के देखावे ला (चित्र S1E)। संक्षेप में कहल जाव त ई आंकड़ा व्यवहार्य पीएन के तीव्र आ विशिष्ट अलगाव खातिर हमनी के योजना के मान्यता दिहलस। चूँकि इस्तेमाल कइल गइल L7-cre ड्राइवर सिस्टम प्रसव (23) के बाद पहिला हफ्ता में मोज़ेक पुनर्संयोजन के प्रेरित करेला, हमनी के CTRL से चूहा के कलिंग करे लगनी जा आ सशर्त (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) न्यूरॉन एकट्ठा करे के। पुनर्संयोजन पूरा होखला के बाद 4 हफ्ता के उमिर में एकरा के Mfn2cKO कहल जाला। अंतिम बिंदु के रूप में, हमनी के 8 सप्ताह के उम्र के चयन कईनी जब पीएन परत स्पष्ट माइटोकॉन्ड्रिया के टुकड़ा (चित्र 1 बी अवुरी चित्र S1A) के बावजूद अभी तक बरकरार रहे। कुल मिलाके, हमनी के कुल 3013 प्रोटीन के मात्रा निर्धारित कईनी जा, जवना में से लगभग 22% माइटोकॉन्ड्रिया (चित्र 1 ई) (चित्र 1 ई) (24) के रूप में माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीओम के आधार प माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन प आधारित रहे। 8वाँ हप्ता में कइल गइल डिफरेंसियल जीन एक्सप्रेशन एनालिसिस से पता चलल कि सभ प्रोटीन सभ में से खाली 10.5% में काफी बदलाव भइल (चित्र 1F आ चित्र S1F), जेह में से 195 प्रोटीन सभ डाउन-रेगुलेटेड आ 120 प्रोटीन सभ अप-रेगुलेटेड रहलें (चित्र 1F)। इहाँ ई बतावल जाय कि एह डेटा सेट के "इनोवेटिव पथ एनालिसिस" से पता चले ला कि डिफरेंसियल रूप से एक्सप्रेस कइल जीन सभ मुख्य रूप से बिसेस मेटाबोलिक पथ सभ के प्रतिबंधित सेट से संबंधित होलें (चित्र 1G)। मजेदार बात ई बा कि, हालाँकि, ऑक्सफोस आ कैल्शियम सिग्नलिंग से संबंधित रास्ता सभ के डाउन-रेगुलेशन फ्यूजन के कमी वाला पीएन सभ में माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन के इंडक्शन के पुष्टि करे ला, बाकी श्रेणी सभ जे मुख्य रूप से अमीनो एसिड मेटाबोलिज्म के सामिल करे लीं, काफी अप-रेगुलेट होलीं, ई माइटोकॉन्ड्रिया पीएन सभ में होखे वाला मेटाबॉलिज्म के अनुरूप बा। रिवायरिंग लगातार होला। विकार हो गइल बा.
(ए) CTRL आ Mfn2cKO चूहा के सेरिबेलर खंड के प्रतिनिधि कॉनफोकल फोटोग्राफ जवना में पीएन (कैल्बिंडिन, ग्रे) के प्रगतिशील नुकसान देखावल गइल बा; नाभिक के डीएपीआई से काउंटरस्टेन कइल गइल। (बी) (ए) के मात्रा निर्धारण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण, *** पी <0.001; एन = तीन चूहों से 4 से 6 वृत्त)। (ग) प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह के बारे में बतावल गइल बा। (D) पुर्किन्जे (ऊपर) आ अन्य कोशिका प्रकार (बीच) खातिर विशिष्ट मार्करन के हीट मैप वितरण। (ई) वेन आरेख जवना में वर्गीकृत पीएन में पहचानल गइल माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन के संख्या देखावल गइल बा। (F) 8 सप्ताह (1.3 के महत्व कट-ऑफ मान) पर Mfn2cKO न्यूरॉन्स में अंतर से व्यक्त प्रोटीन के ज्वालामुखी प्लॉट। (जी) रचनात्मकता मार्ग विश्लेषण में 8 सप्ताह के रूप में वर्गीकृत Mfn2cKO पीएन में पांच सबसे महत्वपूर्ण अप-रेगुलेशन (लाल) अवुरी डाउन-रेगुलेशन (नीला) मार्ग देखावल गईल बा। हर पता चलल प्रोटीन के औसत अभिव्यक्ति स्तर देखावल गइल बा। ग्रेस्केल हीट मैप: समायोजित पी मान। ns, महत्वपूर्ण नइखे।
प्रोटीओमिक्स के डेटा से पता चलल कि कॉम्प्लेक्स I, III, आ IV के प्रोटीन एक्सप्रेशन धीरे-धीरे कम हो गइल। कॉम्प्लेक्स I, III, आ IV सभ में जरूरी mtDNA-एन्कोडेड सबयूनिट सभ के सामिल कइल गइल जबकि कॉम्प्लेक्स II, जे खाली न्यूक्लियर-कोड कइल गइल रहल, मूल रूप से अप्रभावित रहल (चित्र 2A आ चित्र S2A)। . प्रोटीओमिक्स के परिणाम के अनुरूप, सेरिबेलर ऊतक खंड के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री से पता चलल कि पीएन में कॉम्प्लेक्स IV के MTCO1 (माइटोकॉन्ड्रिया साइटोक्रोम सी ऑक्सीडेज सबयूनिट 1) सबयूनिट स्तर धीरे-धीरे कम हो गईल (चित्र 2 बी)। mtDNA-एन्कोडेड सबयूनिट Mtatp8 में काफी कमी आइल (चित्र S2A), जबकि न्यूक्लियर-एन्कोडेड एटीपी सिंथेज सबयूनिट के स्टेडी-स्टेट लेवल में कवनो बदलाव ना भइल, जवन कि ज्ञात स्थिर एटीपी सिंथेज सबएसेम्बली F1 कॉम्प्लेक्स के अनुरूप होला जब mtDNA एक्सप्रेशन स्थिर होखे। गठन सुसंगत बा। बाधा (7) के बा। रियल-टाइम पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा छाँटल गइल Mfn2cKO पीएन सभ में mtDNA स्तर के मूल्यांकन से mtDNA कॉपी नंबर में धीरे-धीरे कमी के पुष्टि भइल। नियंत्रण समूह के तुलना में, 8 सप्ताह के उमिर में, mtDNA के स्तर के लगभग 20% ही बरकरार रहे (चित्र 2C)। एह परिणाम सभ के अनुरूप, डीएनए के पता लगावे खातिर Mfn2cKO पीएन सभ के कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी धुंधलापन माइटोकॉन्ड्रिया न्यूक्लियोटाइड सभ के समय पर निर्भर खपत देखावे ला (चित्र 2 डी)। हमनी के पाता चलल कि माइटोकॉन्ड्रिया प्रोटीन के गिरावट अवुरी तनाव के प्रतिक्रिया में शामिल सिर्फ कुछ उम्मीदवार के अप-रेगुलेट भईल, जवना में Lonp1, Afg3l2 अवुरी Clpx, अवुरी OXPHOS कॉम्प्लेक्स असेंबली फैक्टर शामिल रहले। एपोप्टोसिस में शामिल प्रोटीन के स्तर में कवनो महत्वपूर्ण बदलाव के पता ना चलल (चित्र S2B)। एही तरे हमनी के पाता चलल कि कैल्शियम परिवहन में शामिल माइटोकॉन्ड्रिया अवुरी एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम चैनल में मात्र छोट-मोट बदलाव होखेला (चित्र S2C)। एकरे अलावा, ऑटोफेजी से संबंधित प्रोटीन सभ के मूल्यांकन में कौनों खास बदलाव ना पावल गइल, ई इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री आ इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्र S3) द्वारा इन विवो में देखल गइल ऑटोफेगोसोम सभ के लउके वाला इंडक्शन के अनुरूप बा। हालाँकि, पीएन सभ में प्रगतिशील ऑक्सफोस डिसफंक्शन के साथ अल्ट्रास्ट्रक्चरल माइटोकॉन्ड्रिया में स्पष्ट बदलाव भी होला। माइटोकॉन्ड्रिया समूह सभ के 5 आ 8 हप्ता के उमिर के Mfn2cKO PN सभ के कोशिका शरीर आ डेंड्रिटिक पेड़ सभ में देखल जा सके ला आ भीतरी झिल्ली के संरचना में गहिरा बदलाव भइल बा (चित्र S4, A आ B)। एह अल्ट्रास्ट्रक्चरल बदलाव आ mtDNA में काफी कमी के अनुरूप, टेट्रामिथाइलरोडामाइन मिथाइल एस्टर (TMRM) के साथ तीव्र सेरेब्रल सेरिबेलर स्लाइस के विश्लेषण से पता चलल कि Mfn2cKO पीएन में माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली के क्षमता में काफी कमी आइल (चित्र S4C)।
(ए) ऑक्सफोस परिसर के अभिव्यक्ति स्तर के समय पाठ्यक्रम विश्लेषण। खाली 8 हफ्ता में पी <0.05 वाला प्रोटीन पर विचार करीं (दू-तरफा एनोवा)। बिंदीदार रेखा: सीटीआरएल के तुलना में कवनो समायोजन ना। (B) बाईं ओर: एंटी-एमटीसीओ1 एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) से लेबल कइल गइल सेरिबेलर खंड के उदाहरण। पुर्किन्जे सेल बॉडी के कब्जा वाला इलाका पीला रंग से ढंकल बा। दाहिने: MTCO1 स्तर के मात्रा निर्धारण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; n = 7 से 20 कोशिका तीन चूहों से विश्लेषण)। (सी) छंटाई पीएन में mtDNA कॉपी संख्या के qPCR विश्लेषण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; एन = 3 से 7 चूहों)। (D) बाईं ओर: एंटी-डीएनए एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) से लेबल कइल सेरिबेलर स्लाइस के उदाहरण। पुर्किन्जे सेल बॉडी के कब्जा वाला इलाका पीला रंग से ढंकल बा। दाहिने: mtDNA घाव के मात्रा निर्धारण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; तीन चूहों से n = 5 से 9 कोशिका)। (ई) एगो तीव्र सेरिबेलर खंड के उदाहरण जवना में पूरा कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग में माइटोवाईएफपी + पुर्किन्जे कोशिका (तीर) देखावल गइल बा। (च) चतुर्थ वक्र के मात्रा निर्धारण। (जी) सीटीआरएल आ Mfn2cKO पुर्किन्जे कोशिका में डिपोलराइजिंग करंट इंजेक्शन के प्रतिनिधि रिकार्डिंग। टॉप ट्रेस: ​​पहिला पल्स जवन एपी के ट्रिगर कईले रहे। नीचे के ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति। (ज) पोस्टसिनैप्टिक सहज इनपुट (sPSPs) के मात्रा निर्धारण। प्रतिनिधि रिकार्डिंग ट्रेस आ एकर ज़ूम अनुपात (I) में देखावल गइल बा। विचरण के एकतरफा विश्लेषण तीन चूहों से n = 5 से 20 कोशिकाओं के विश्लेषण कइलस। डेटा के औसत±SEM के रूप में व्यक्त कइल जाला; *पी <0.05 के बा; **पी <0.01 के बा; ***पी <0.001 के बा। (जे) छिद्रित पैच क्लैंप मोड के उपयोग से रिकॉर्ड कइल गइल सहज एपी के प्रतिनिधि निशान। शीर्ष ट्रेस: ​​अधिकतम एपी आवृत्ति के बा। नीचे के ट्रेस: ​​एकल एपी के ज़ूम। (के) (जे) के अनुसार औसत आ अधिकतम एपी आवृत्ति के मात्रा निर्धारित करीं। मान-व्हिटनी के परीक्षण कइल जाला; n = 5 कोशिका के चार चूहों से विश्लेषण कइल गइल। डेटा के औसत±SEM के रूप में व्यक्त कइल जाला; महत्वपूर्ण नइखे।
8 सप्ताह के Mfn2cKO PN में स्पष्ट OXPHOS नुकसान के पता चलल, जवन बतावत बा कि न्यूरॉन के शारीरिक कामकाज बहुत असामान्य बा। एहसे, हमनी के तीव्र सेरिबेलर स्लाइस (चित्र 2 ई) में पूरा कोशिका पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग क के 4 से 5 सप्ताह अवुरी 7 से 8 सप्ताह में ऑक्सफोस के कमी वाला न्यूरॉन्स के निष्क्रिय विद्युत विशेषता के विश्लेषण कईनी। अप्रत्याशित रूप से, Mfn2cKO न्यूरॉन के औसत आराम झिल्ली के क्षमता अवुरी इनपुट प्रतिरोध नियंत्रण के समान रहे, हालांकि कोशिका के बीच सूक्ष्म अंतर रहे (तालिका 1)। एही तरे 4 से 5 सप्ताह के उम्र में करंट-वोल्टेज संबंध (IV वक्र) में कवनो खास बदलाव ना पावल गईल (चित्र 2F)। हालाँकि, 7 से 8 हप्ता के उमिर के कौनों Mfn2cKO न्यूरॉन IV रेजीम (हाइपरपोलराइजेशन स्टेप) से ना बचल, ई बतावे ला कि एह देर के दौर में हाइपरपोलराइजेशन के क्षमता के प्रति साफ संवेदनशीलता बा। एकरे बिपरीत, Mfn2cKO न्यूरॉन सभ में, रिपीटिव एक्शन पोटेंशियल (AP) डिस्चार्ज पैदा करे वाला डिपोलराइजिंग करंट सभ के बढ़िया से सहन कइल जाला, ई बतावे ला कि इनहन के समग्र डिस्चार्ज पैटर्न 8 हप्ता के नियंत्रण न्यूरॉन सभ से काफी अलग ना होला (तालिका 1 आ चित्र 2G)। एही तरे, स्वतःस्फूर्त पोस्टसिनैप्टिक करंट (sPSCs) के आवृत्ति आ आयाम नियंत्रण समूह के तुलना में तुलनीय रहल आ घटना सभ के आवृत्ति 4 हप्ता से 5 हप्ता से बढ़ के 7 हप्ता से 8 हप्ता ले बढ़ गइल आ एकरे समान बढ़ती भइल (चित्र 2, H आ I)। पीएन (25) में सिनैप्टिक परिपक्वता के अवधि। छिद्रित पीएनएस पैच के बाद भी अइसने परिणाम मिलल। ई बिन्यास सेलुलर एटीपी दोष के संभावित मुआवजा के रोके ला, जइसे कि पूरा कोशिका पैच क्लैंप रिकार्डिंग में हो सके ला। खास तौर प, Mfn2cKO न्यूरॉन्स के आराम झिल्ली के क्षमता अवुरी सहज फायरिंग आवृत्ति प्रभावित ना भईल (चित्र 2, जे अवुरी के)। संछेप में, ई परिणाम बतावे लें कि स्पष्ट ऑक्सफोस डिसफंक्शन वाला पीएन सभ हाई-फ्रीक्वेंसी डिस्चार्ज पैटर्न के बढ़िया से सामना क सके लें, ई बतावे ला कि एगो मुआवजा तंत्र बा जे इनहन के लगभग सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिस्पांस के बनाए रखे के इजाजत देला।
डेटा औसत ± एसईएम (विचरण के एकतरफा विश्लेषण, होल्म-सिडक के बहु तुलना परीक्षण; * पी <0.05) के रूप में व्यक्त कइल गइल बा। इकाई संख्या के कोष्ठक से देखावल गइल बा।
हमनी के जांच करे खातिर निकलनी जा कि प्रोटीओमिक्स डाटासेट (चित्र 1 जी) में कवनो श्रेणी में अइसन रास्ता शामिल बा कि ना जवन गंभीर ऑक्सफोस के कमी के मुकाबला कर सकेला, जेकरा से ई बतावल जा सकेला कि प्रभावित पीएन लगभग सामान्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी काहे बनाए रख सकेला (चित्र 2, ई से के)। . प्रोटीओमिक्स विश्लेषण से पता चलल कि शाखाबद्ध श्रृंखला अमीनो एसिड (BCAA) के कैटाबोलिज्म में शामिल एंजाइम सभ के काफी अप-रेगुलेट कइल गइल (चित्र 3A आ चित्र S5A), आ अंतिम उत्पाद एसिटाइल-कोए (CoA) भा सुक्सिनिल CoA धमनीकाठिन्य एसिड (TCA) चक्र में ट्राइकार्बोक्जिलेट सभ के पूरक हो सके ला। हमनी के पाता चलल कि बीसीएए ट्रांसएमिनेज़ 1 (बीसीएटी1) अवुरी बीसीएटी2 दुनो के सामग्री बढ़ गईल। इ लोग α-कीटोग्लूटारेट ( 26 ) से ग्लूटामेट पैदा क के बीसीएए कैटाबोलिज्म के पहिला कदम के उत्प्रेरक बनवले। शाखाबद्ध श्रृंखला कीटो एसिड डिहाइड्रोजनेज (BCKD) परिसर के बनावे वाली सगरी सबयूनिट सभ अपरेगुलेट होलीं (कम्प्लेक्स परिणामस्वरूप बीसीएए कार्बन कंकाल के बाद के आ अपरिवर्तनीय डिकार्बोक्जिलेशन के उत्प्रेरक होला) (चित्र 3A आ चित्र S5A)। हालाँकि, सॉर्ट कइल पीएन में खुद बीसीएए में कौनों स्पष्ट बदलाव ना पावल गइल, ई एह जरूरी अमीनो एसिड सभ के बढ़ल सेलुलर अपटेक भा टीसीए चक्र के पूरक के रूप में अन्य स्रोत (ग्लूकोज भा लैक्टिक एसिड) के इस्तेमाल के कारण हो सके ला (चित्र S5B)। ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन सभ में भी 8 हप्ता के उमिर में ग्लूटामाइन अपघटन आ ट्रांसएमिनेसन गतिविधि में बढ़ती देखल गइल, जेकरा के माइटोकॉन्ड्रिया एंजाइम ग्लूटामिनेज (GLS) आ ग्लूटामाइन पाइरुवेट ट्रांसएमिनेज़ 2 (GPT2) के अप-रेगुलेशन से देखावल जा सके ला (चित्र 3, ए आ सी)। इहाँ ई बतावल जाय कि जीएलएस के अप-रेगुलेशन स्प्लिस्ड आइसोफॉर्म ग्लूटामिनेज सी (GLS-GAC) तक ले सीमित होला (Mfn2cKO/CTRL के बदलाव लगभग 4.5 गुना, P = 0.05 होला), आ कैंसर के ऊतक सभ में एकर बिसेस अप-रेगुलेशन माइटोकॉन्ड्रिया जैव ऊर्जा के समर्थन क सके ला। (27) के बा।
(ए) हीट मैप में 8 सप्ताह में निर्दिष्ट मार्ग खातिर प्रोटीन के स्तर में गुना बदलाव देखावल गइल बा। (B) एंटी-पीसीएक्स एंटीबॉडी (स्केल बार, 20 माइक्रोन) के साथ लेबल कइल गइल सेरिबेलर स्लाइस के उदाहरण। पीला तीर पुर्किन्जे कोशिका शरीर के ओर इशारा करेला। (सी) समय पाठ्यक्रम प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण धमनीकाठिन्य (बहुत टी-परीक्षण, * एफडीआर <5%; एन = 3-5 चूहा) के लिए एक महत्वपूर्ण उम्मीदवार के रूप में पहचानल गइल। (D) ऊपर: एगो योजनाबद्ध आरेख जेह में [1-13C]पाइरुवेट ट्रेसर में मौजूद लेबल वाला कार्बन में प्रवेश के अलग-अलग तरीका देखावल गइल बा (यानी, पीडीएच भा ट्रांस-आर्टेरियल मार्ग के माध्यम से)। नीचे: वायलिन चार्ट में एक्यूट सेरिबेलर स्लाइस सभ के [1-13C]पाइरुवेट (पेयर टी-टेस्ट; ** P <0.01) से लेबल कइला के बाद एस्पार्टिक एसिड, साइट्रिक एसिड आ मैलिक एसिड में बदलल गइल सिंगल-लेबल कार्बन (M1) के प्रतिशत देखावल गइल बा। (ई) संकेतित मार्ग के व्यापक समय इतिहास विश्लेषण। खाली 8 हफ्ता में P<0.05 वाला प्रोटीन पर विचार करीं . डैश लाइन: कवनो समायोजन मान ना (विचरण के दू-तरफा विश्लेषण; * पी <0.05; *** पी <0.001)। डेटा औसत±SEM के रूप में व्यक्त कइल गइल बा।
हमनी के विश्लेषण में बीसीएए कैटाबोलिज्म प्रमुख अप-रेगुलेशन मार्ग में से एगो बन गईल बा। ई तथ्य मजबूती से बतावे ला कि ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन में टीसीए चक्र में प्रवेश करे वाला वेंटिलेशन के मात्रा में बदलाव हो सके ला। ई न्यूरॉनल मेटाबोलिक रिवाइरिंग के एगो प्रमुख रूप के प्रतिनिधित्व क सके ला, जेकर सीधा असर न्यूरॉनल फिजियोलॉजी आ गंभीर ऑक्सफोस डिसफंक्शन के रखरखाव के दौरान जिंदा रहे पर पड़ सके ला। एह परिकल्पना के अनुरूप, हमनी के पाता चलल कि मुख्य एंटी-एथेरोस्क्लेरोटिक एंजाइम PCx अप-रेगुलेटेड बा (Mfn2cKO / CTRL लगभग 1.5 गुना बदल जाला; चित्र 3 ए), जवन पाइरुवेट के ऑक्सालोएसीटेट (28) में बदले के उत्प्रेरक होला, जवन मस्तिष्क के ऊतक में मानल जाला The expression in एस्ट्रोसाइट्स (29, 30) तक सीमित बा। प्रोटीओमिक्स के परिणाम के अनुरूप, कॉनफोकल माइक्रोस्कोपी से पता चलल कि ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन में पीसीएक्स अभिव्यक्ति विशेष रूप से आ काफी बढ़ल रहे, जबकि पीसीएक्स रिएक्टिविटी मुख्य रूप से नियंत्रण के सटल बर्गमैन ग्लिया कोशिका तक सीमित रहे (चित्र 3 बी)। पीसीएक्स के देखल गइल अपरेग्यूलेशन के कार्यात्मक रूप से परीक्षण करे खातिर, हमनी के तीव्र सेरिबेलर स्लाइस के [1-13C] पाइरुवेट ट्रेसर के साथ इलाज कइनी जा। जब पाइरुवेट के पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज (PDH) द्वारा ऑक्सीडाइज कइल गइल, एकर आइसोटोप लेबल गायब हो गइल , लेकिन TCA चक्र मध्यवर्ती में शामिल होला जब पाइरुवेट के संवहनी रिएक्शन द्वारा चयापचय होला (चित्र 3D)। हमनी के प्रोटीओमिक्स डेटा के समर्थन में, हमनी के Mfn2cKO स्लाइस के एस्पार्टिक एसिड में एह ट्रेसर से मार्कर के बहुत संख्या देखनी जा, जबकि साइट्रिक एसिड अवुरी मैलिक एसिड में भी मध्यम रुझान रहे, हालांकि महत्वपूर्ण ना रहे (चित्र 3 डी)।
माइटोपार्क चूहा सभ के डोपामाइन न्यूरॉन सभ में माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के कारण डोपामाइन न्यूरॉन सभ के बिसेस रूप से माइटोकॉन्ड्रिया ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर ए जीन (Tfam) (चित्र S6B) के नष्ट कइल गइल, पीसीएक्स एक्सप्रेशन भी काफी अप-रेगुलेट भइल (31), ई बतावे ला कि एसीटोन एसिड धमनीकाठिन्य न्यूरॉनल के बिकार के दौरान बेमारी के घटना नियंत्रित हो जाले शरीर में ऑक्सफोस होला। ध्यान देवे वाला बात ई बा कि ई पावल गइल बा कि अनोखा एंजाइम (32-34) जे न्यूरॉन सभ में एक्सप्रेस हो सके लें जे धमनीकाठिन्य से जुड़ल हो सके लें, ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन सभ में काफी अप-रेगुलेट होलें, जइसे कि प्रोपिओनाइल-कोए कार्बोक्जिलेज (PCC-A), मैलोनाइल-कोए प्रोपिओनाइल-कोए के सुक्सिनिल-कोए आ माइटोकॉन्ड्रिया मैलिक 3 (ME3), एंजाइम में बदल देला। जेकर मुख्य भूमिका मैलेट से पाइरुवेट के बरामद कइल होला (चित्र 3, ए आ सी) (33, 35)। एकरा अलावे, हमनी के Pdk3 एंजाइम में काफी बढ़ोतरी मिलल, जवन फॉस्फोरिलेशन करेला अवुरी ए प्रकार से पीडीएच (36) के निष्क्रिय करेला, जबकि पीडीएच चाहे खुद पीडीएच एंजाइम परिसर के सक्रिय करेवाला पीडीपी 1 एंजाइम में कवनो बदलाव ना पावल गईल (चित्र 3 ए)। लगातार, Mern2cKO पीएन में, Ser293 (पीडीएच के एंजाइम गतिविधि के रोके खातिर जानल जाला) में पीडीएच परिसर के पाइरुवेट डिहाइड्रोजनेज E1 घटक के α1 सबयूनिट α (PDHE1α) सबयूनिट के फॉस्फोरिलेशन बढ़ल (चित्र S6C) (चित्र S6C)। पाइरुवेट के कवनो संवहनी पहुँच ना होला।
अंत में, हमनी के पाता चलल कि सेरीन अवुरी ग्लाइसिन बायोसिंथेसिस के सुपर पथ, संबंधित माइटोकॉन्ड्रिया फोलेट (1C) चक्र अवुरी प्रोलाइन बायोसिंथेसिस (चित्र 1G अवुरी चित्र S5C) सभ सक्रियण प्रक्रिया के दौरान, रिपोर्ट के मुताबिक, काफी अप-रेगुलेटेड होखेला। आसपास के ऊतक माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन ( 5-7 ) के साथ सक्रिय हो जालें। एह प्रोटीओमिक्स डेटा के समर्थन करे वाला कॉनफोकल एनालिसिस से पता चलल कि ऑक्सफोस गायब होखे वाला पीएन में 8 हप्ता के चूहा सभ के सेरिबेलर स्लाइस सभ के माइटोकॉन्ड्रिया फोलेट चक्र के प्रमुख एंजाइम सेरीन हाइड्रोक्सीमिथाइलट्रांसफरेज़ 2 (SHMT2) के अधीन कइल गइल। महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (चित्र S5D) के बा। 13 गो सीयू-ग्लूकोज-इन्क्यूबेटेड एक्यूट सेरिबेलर स्लाइस सभ में, मेटाबोलिक ट्रेसिंग प्रयोग सभ से सेरीन आ प्रोलाइन बायोसिंथेसिस के अप-रेगुलेशन के अउरी पुष्टि भइल, ई बतावे ला कि सेरीन आ प्रोलाइन में कार्बन आइसोफॉर्म सभ के फ्लक्स बढ़ गइल (चित्र S5E)। चूँकि GLS आ GPT2 द्वारा बढ़ावा दिहल जाए वाली रिएक्शन सभ ग्लूटामाइन से ग्लूटामेट के संश्लेषण आ ग्लूटामेट आ α-कीटोग्लूटारेट के बीच ट्रांसएमिनेशन खातिर जिम्मेदार होलीं, इनहन के अपरेग्यूलेशन बतावे ला कि OXPHOS-कमी वाला न्यूरॉन सभ में ग्लूटामेट के मांग बढ़ जाला , एकर मकसद प्रोलाइन के बढ़ल जैवसंश्लेषण के बनाए रखल हो सके ला (चित्र S5C)। एह बदलाव सभ के बिपरीत, पीएन-विशिष्ट Mfn2cKO चूहा सभ से सेरिबेलर एस्ट्रोसाइट्स के प्रोटीओमिक बिस्लेषण से पता चलल कि ई रास्ता (सब एंटीपेरोक्साइडेज सभ सहित) सभ में अभिव्यक्ति में कौनों खास बदलाव ना भइल, एह तरीका से ई देखावल गइल कि ई मेटाबोलिक रीडायरेक्शन डिग्रेडेड पीएन के चयनात्मक बा (चित्र S6, डी से जी)।
संक्षेप में, एह बिस्लेषण सभ से पीएन सभ में बिसेस मेटाबोलिक रास्ता सभ के टेम्पोरल सक्रियण के काफी अलग पैटर्न के पता चलल। हालाँकि, असामान्य न्यूरॉनल माइटोकॉन्ड्रिया के कामकाज के कारण सुरुआती धमनीकाठिन्य आ 1C रिमोडलिंग (चित्र 3E आ चित्र S5C) हो सके ला, आ इहाँ तक कि I आ IV परिसर सभ के अभिव्यक्ति में अनुमानित बदलाव भी हो सके ला, सेरीन डी नोवो संश्लेषण में बदलाव खाली ई खाली देर के दौर में ही साफ हो गइल। ऑक्सफोस के विकार (चित्र 3 ई आ चित्र S5C)। ई खोज एगो क्रमिक प्रक्रिया के परिभाषित करे लीं जेह में तनाव से पैदा होखे वाला माइटोकॉन्ड्रिया (1C चक्र) आ साइटोप्लाज्मिक (सेरिन बायोसिंथेसिस) टीसीए चक्र में धमनीकाठिन्य के बढ़ती के साथ समन्वयात्मक रूप से प्रतिक्रिया देलें आ न्यूरॉनल मेटाबोलिज्म के नया रूप देलें।
8 हप्ता के ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन सभ उच्च आवृत्ति के उत्तेजना गतिविधि के बना के रख सके लें आ माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के भरपाई करे खातिर महत्वपूर्ण मेटाबोलिक रिकनेक्शन से गुजर सके लें। एह खोज से एगो रोचक संभावना पैदा हो रहल बा कि एह घरी भी एह कोशिका सभ के न्यूरोडिजनरेशन में देरी भा रोके खातिर चिकित्सीय हस्तक्षेप भी हो सके ला। देरी। हमनी का एह संभावना के दू गो स्वतंत्र हस्तक्षेप का माध्यम से हल कइनी जा. पहिला तरीका में, हमनी के Cre-निर्भर एडेनो-एसोसिएटेड वायरस (AAV) वेक्टर के डिजाइन कईनी जा ताकि MFN2 के विवो में OXPHOS के कमी वाला पीएन में चुनिंदा रूप से व्यक्त कईल जा सके (चित्र S7A)। MFN2 आ फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन mCherry (Mfn2-AAV) के एन्कोडिंग करे वाला एएवी के इन विट्रो में प्राथमिक न्यूरॉन संस्कृति सभ में सत्यापन कइल गइल, जेकरा चलते MFN2 के Cre-निर्भर तरीका से एक्सप्रेस भइल आ माइटोकॉन्ड्रिया के आकृति बिज्ञान के बचावल गइल, जेकरा से Mfn2cKO न्यूरॉन सभ में न्यूरोम्यूटेशन के रोकल गइल (चित्र S7, B, D आ E)। एकरा बाद, हमनी के स्टीरियोटैक्टिकली Mfn2cKO अवुरी नियंत्रण चूहा के सेरिबेलर कॉर्टेक्स में 8 सप्ताह के Mfn2-AAV पहुंचावे खाती विवो प्रयोग कईनी, अवुरी 12 सप्ताह के चूहा के विश्लेषण कईनी (चित्र 4 ए)। इलाज Mfn2cKO चूहों के मौत हो गईल (चित्र 1, ए अवुरी बी) (16)। विवो में वायरल ट्रांसडक्शन के परिणामस्वरूप कुछ सेरिबेलर सर्कल में पीएन के चयनात्मक अभिव्यक्ति भइल (चित्र S7, जी आ एच)। केवल mCherry (Ctrl-AAV) के एक्सप्रेस करे वाला नियंत्रण एएवी के इंजेक्शन से Mfn2cKO जानवरन में न्यूरोडिजनरेशन के डिग्री पर कवनो खास असर ना पड़ल। एकरा विपरीत, Mfn2-AAV के साथ ट्रांसड्यूस्ड Mfn2cKOs के विश्लेषण में पीएन कोशिका परत (चित्र 4, बी अवुरी सी) के एगो महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रभाव देखाई देलस। खासतौर पर न्यूरॉन के घनत्व नियंत्रण जानवर सभ से लगभग अलग ना कइल जा सके ला (चित्र 4, बी आ सी, आ चित्र S7, एच आ आई)। MFN1 के एक्सप्रेशन बाकी MFN2 के ना, न्यूरॉनल मौत के बचावे में ओतने कारगर होला (चित्र 4C आ चित्र S7, C आ F), ई बतावे ला कि एक्टोपिक MFN1 के एक्सप्रेशन MFN2 के कमी के प्रभावी ढंग से पूरक हो सके ला। एकल पीएन स्तर पर आगे के विश्लेषण से पता चलल कि Mfn2-AAV बहुत हद तक माइटोकॉन्ड्रिया के अल्ट्रास्ट्रक्चर के बचा लिहलस, mtDNA स्तर के सामान्य कइलस, आ एंटी-एंजियोजेनेसिस मार्कर PCx के उच्च अभिव्यक्ति के उलट दिहलस (चित्र 4, सी से ई)। बचावल गइल Mfn2cKO चूहा सभ के आराम के स्थिति में दृश्य निरीक्षण से पता चलल कि इनहन के मुद्रा आ मोटर के लच्छन (मूवमेंट S1 से S3) में सुधार भइल। निष्कर्ष में, ई प्रयोग सभ बतावे लें कि ऑक्सफोस में बहुत कमी वाला पीएन सभ में MFN2 के देरी से फिर से प्रवेश mtDNA के खपत के उलट देवे आ धमनीकाठिन्य पैदा करे खातिर पर्याप्त बाटे, जेकरा से इन विवो में एक्सोन के क्षय आ न्यूरॉनल मौत के रोके के काम हो सके ला।
(ए) एगो योजना जवन MFN2 के एन्कोडिंग करे वाला एएवी के इंजेक्शन लगावे खातिर प्रयोगात्मक कार्यक्रम देखावेला जब संकेतित मेटाबोलिक मार्ग सक्रिय होला। (B) 8 सप्ताह में Mfn2cKO चूहों के साथ ट्रांसड्यूस कइल गइल आ एंटी-कैलबिंडिन एंटीबॉडी के साथ लेबल कइल गइल 12 हफ्ता के सेरिबेलर खंड के प्रतिनिधि कॉनफोकल फोटो। दाहिने: एक्सन फाइबर के स्केलिंग। एक्सन जूम के पैमाना 450 आ 75 माइक्रोन बा। (सी) बाईं ओर: एएवी ट्रांसडक्शन लूप (एएवी +) (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; एन = 3 चूहों) में पुर्किन्जे कोशिका घनत्व के मात्रा निर्धारण। दाहिने: 12 सप्ताह में ट्रांसड्यूस्ड पीएन में mtDNA फोकस विश्लेषण (अनपेयर टी-टेस्ट; एन = तीन चूहों से 6 कोशिका)। * पी <0.05 के बा; ** पी <0.01 के बा। (D) संकेत वायरल वैक्टर के साथ ट्रांसड्यूस Mfn2cKO सेरिबेलर खंड के पीएन के प्रतिनिधि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। गुलाबी रंग के मुखौटा डेंड्राइट्स के कब्जा वाला इलाका के देखावे ला आ पीला बिंदीदार वर्ग दाहिने ओर दिहल ज़ूम के देखावे ला; n नाभिक के प्रतिनिधित्व करेला। स्केल बार, 1 माइक्रोन के बा। (ई) 12 हफ्ता में ट्रांसड्यूस्ड पीएन में पीसीएक्स धुंधलापन के उदाहरण देखावत बा। पैमाने पर बार, 20μm के बा। ओई, ओवरएक्सप्रेशन के बारे में बतावल गइल बा; एफसी, गुना बदलाव के बा।
अंत में, हमनी के ओ पीएन में पेरोक्साइडेज से उत्पन्न कोशिका के जीवित रहे के महत्व के जांच कईनी, जवना में ऑक्सफोस के विकार के अनुभव भईल बा। हमनी के माउस PCx mRNA (AAV-shPCx) के विशेष रूप से निशाना बनावत AAV-shRNA (छोट हेयरपिन आरएनए) के एन्कोडिंग करे वाला mCherry पैदा कईनी, अवुरी Mfn2cKO चूहा के सेरिबैलम में वायरस चाहे ओकर स्क्रैम्बल नियंत्रण (AAV-scr) के इंजेक्शन देनी। इंजेक्शन उमिर के चउथा हफ्ता (चित्र 5 ए) में कइल गइल ताकि ओह अवधि के दौरान प्रभावी पीसीएक्स नॉक डाउन हासिल कइल जा सके जब पीसीएक्स एक्सप्रेशन बढ़ल (चित्र 3 सी) आ पीएन सेल परत अभी भी बरकरार रहे (चित्र 1 ए)। इहाँ इहो बतावल जरूरी बा कि पीसीएक्स (चित्र S8A) के गिरावे से पीएन मौत में काफी तेजी आवेला, जवन संक्रमण के एकमात्र प्रतिबंधित अंगूठी ह (चित्र 5, बी अवुरी सी)। पीसीएक्स अप-रेगुलेशन से प्रेरित चयापचय प्रभाव के तंत्र के समझे के क्रम में, हमनी के पीसीएक्स नॉक डाउन के बाद पीएन के रेडॉक्स स्थिति के अध्ययन कईनी अवुरी एएवी-मध्यस्थता ऑप्टिकल बायोसेंसर Grx1-roGFP2 के एक संगे व्यक्त कईल गईल (चित्र S8, बी से डी) ग्लूटाथियोन के मूल्यांकन करे खाती पेप्टाइड रेडॉक्स क्षमता (38) के सापेक्षिक बदलाव। फिर, हमनी के 7 सप्ताह के Mfn2cKO या नियंत्रण littermates के तीव्र मस्तिष्क स्लाइस में दू-फोटॉन प्रतिदीप्ति जीवनकाल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (FLIM) प्रदर्शन कइनी जा ताकि FLIM स्थिति (चित्र S8, ई से जी) के सत्यापन के बाद साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्थिति में संभावित बदलाव के पता लगावल जा सके। विश्लेषण में पीसीएक्स अभिव्यक्ति के कमी वाला एकल Mfn2cKO पीएन के ऑक्सीकरण अवस्था में काफी बढ़ोतरी देखल गइल, जवन नियंत्रण न्यूरॉन भा Mfn2cKO पीएन से अलग बा जवन खाली स्क्रैम्बल shRNA के अभिव्यक्ति करेला (चित्र 5, डी आ ई)। जब पीसीएक्स एक्सप्रेशन के डाउन-रेगुलेट कइल गइल तब बहुत ऑक्सीडाइज्ड स्टेट देखावे वाला Mfn2cKO पीएन सभ के प्रतिशत में तीन गुना से ढेर बढ़ती भइल (चित्र 5E), ई बतावे ला कि पीसीएक्स अप-रेगुलेशन डिजनरेट न्यूरॉन सभ के रेडॉक्स क्षमता के बरकरार रखे ला।
(ए) एगो योजना जवन shPCx के एन्कोडिंग करे वाला एएवी के इंजेक्शन लगावे खातिर प्रयोगात्मक कार्यक्रम देखावेले जब संकेतित मेटाबोलिक मार्ग सक्रिय होला। (B) Mfn2cKO चूहों में 8 सप्ताह के सेरिबेलर खंड के प्रतिनिधि कॉनफोकल फोटोग्राफ ट्रांसड्यूस आ 4 सप्ताह में एंटी-कैल्सीन्यूरिन एंटीबॉडी के साथ लेबल कइल गइल। पैमाने पर बार, 450μm के बा। (सी) एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप में पुर्किन्जे कोशिका घनत्व के मात्रा निर्धारण (विचरण के एकतरफा विश्लेषण; एन = 3 से 4 चूहों)। डेटा के औसत±SEM के रूप में व्यक्त कइल जाला; ***पी <0.001 के बा। (D) प्रतिनिधि FLIM चित्र निर्दिष्ट प्रयोगात्मक परिस्थिति में ग्लूटाथियोन रेडॉक्स सेंसर Grx1-roGFP2 व्यक्त करे वाला 7 सप्ताह के पीएन के औसत जीवन काल देखावेला। एलयूटी (लुक-अप टेबल) अनुपात: जीवित रहे के समय अंतराल (पिकोसेकंड में)। स्केल बार, 25μm के बा। (ई) हिस्टोग्राम (डी) (हर स्थिति के तहत दू चूहा में n = 158 से 368 कोशिका) से Grx1-roGFP2 जीवनकाल मान के वितरण देखावेला। हर हिस्टोग्राम के ऊपर पाई चार्ट: काफी लंबा (लाल, ऑक्सीडाइज) या छोट (नीला, कम) जीवनकाल मान वाला कोशिका सभ के संख्या देखावे ला, जवन CTRL-AAV-scr में औसत जीवनकाल मान के 1 SD से ढेर होला। (F) प्रस्तावित मॉडल न्यूरॉनल पीसीएक्स के अपरेग्यूलेशन के सुरक्षात्मक प्रभाव के दर्शावत बा।
कुल मिला के, हमनी के इहाँ दिहल डेटा बतावे ला कि MFN2 के रि-एक्सप्रेशन से गंभीर ऑक्सफोस के कमी, गंभीर mtDNA के कमी, आ बेहद असामान्य इस्टा नियर आकृति बिज्ञान वाला उन्नत पीएन के पूरा तरीका से बचावल जा सके ला, जेकरा से उन्नत बेमारी सभ में भी लगातार प्रगति हो सके ला। न्यूरोडिजनरेशन कोशिका के मौत से पहिले के स्टेज के रिवर्सिबल सबूत देला। मेटाबोलिक लचीलापन के एह डिग्री पर न्यूरॉन सभ के एथेरोस्क्लेरोसिस (टीसीए चक्र के रिवाइरिंग) पैदा करे के क्षमता से अउरी जोर दिहल जाला, ई ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन सभ में पीसीएक्स एक्सप्रेशन के रोके ला आ कोशिका के मौत के बढ़ावे ला, जेकरा से सुरक्षात्मक भूमिका निभावे ला (चित्र 5F)।
एह अध्ययन में हमनी के सबूत दिहनी जा कि ऑक्सफोस डिसफंक्शन के प्रति पीएन के प्रतिक्रिया मेटाबोलिक प्रोग्राम से सक्रिय होखे वाला डिफरेंसियल एक्टिवेशन पथ के माध्यम से धीरे-धीरे टीसीए चक्र धमनीकाठिन्य में अभिसरण होखे के बा। हमनी के कई गो पूरक तरीका से प्रोटीओमिक विश्लेषण के पुष्टि कईनी अवुरी पाता चलल कि जब गंभीर माइटोकॉन्ड्रिया के विकार से चुनौती दिहल जाला त न्यूरॉन में मेटाबोलिक लोच के एगो पहिले से अज्ञात रूप होखेला। हमनी के हैरानी के बात बा कि पूरा रिवाइरिंग प्रक्रिया जरूरी नईखे कि उ टर्मिनल मेटाबोलिक स्टेट के चिन्हित करे जवन कि धीरे-धीरे अवुरी अपरिवर्तनीय तरीका से न्यूरोडिजनरेशन के संगे होखेला, लेकिन हमनी के आंकड़ा बतावता कि कोशिका के मौत से पहिले के चरण में भी इ एगो रखरखाव न्यूरॉन के गठन क सकता। ई खोज बतावत बा कि न्यूरॉन सभ में शरीर में मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी के काफी डिग्री होला। ई तथ्य साबित करे ला कि बाद में एमएफएन2 के फिर से पेश कइला से प्रमुख मेटाबोलिक मार्कर सभ के एक्सप्रेशन के उलट हो सके ला आ पीएन डिजनरेशन के रोके में मदद मिल सके ला। एकरा उलट इ धमनीकाठिन्य के रोकेला अवुरी नस के तेज करेला। ट्रांससेक्सुअल के नाम से जानल जाला।
हमनी के शोध में सबसे आकर्षक निष्कर्ष में से एगो इ बा कि ऑक्सफोस के कमी वाला पीएन खास तौर प धमनीकाठिन्य के उत्तेजित करेवाला एंजाइम के अप-रेगुलेट क के टीसीए चक्र के चयापचय के संशोधित क सकतारे। मेटाबोलिक पुनर्व्यवस्था कैंसर कोशिका सभ के एगो आम बिसेसता हवे, इनहन में से कुछ टीसीए चक्र के इंटरमीडिएट सभ के पूरक बनावे खातिर ग्लूटामाइन पर निर्भर होलें आ रिड्यूसिंग समकक्ष पैदा करे लें, जे श्वसन श्रृंखला के चलावे लें आ लिपिड आ न्यूक्लियोटाइड बायोसिंथेसिस अग्रदूत सभ के उत्पादन के बरकरार रखे लें (39 , 40)। हाल के एगो अध्ययन से पता चलल कि ऑक्सफोस के बिकार के अनुभव करे वाला परिधीय ऊतक सभ में, ग्लूटामाइन/ग्लूटामेट मेटाबोलिज्म के फिर से जुड़ाव भी एगो प्रमुख बिसेसता हवे (5, 41), जहाँ टीसीए चक्र में ग्लूटामाइन के प्रवेश के दिशा ऑक्सफोस के चोट के गंभीरता के कारण (41) पर निर्भर करे ला। ). हालाँकि, शरीर में न्यूरॉनल मेटाबोलिक प्लास्टिसिटी के कौनों समानता आ बेमारी के संदर्भ में एकर संभावित प्रासंगिकता पर साफ सबूत के कमी बा। हाल के इन विट्रो अध्ययन में, प्राथमिक कॉर्टिकल न्यूरॉन सभ के न्यूरोट्रांसमिशन खातिर ग्लूटामेट पूल सभ के मोबिलाइज करे के देखावल गइल, जेकरा से मेटाबोलिक तनाव के स्थिति में ऑक्सीडेटिव मेटाबोलिज्म आ एथेरोस्क्लेरोसिस के बढ़ावा मिले ला ( 42 )। ध्यान देवे वाला बात बा कि टीसीए चक्र एंजाइम सुसिनेट डिहाइड्रोजनेज के औषधीय निरोध के तहत, पाइरुवेट कार्बोक्जिलेशन के संवर्धित सेरिबेलर दाना न्यूरॉन्स में ऑक्सालोएसिटेट के संश्लेषण के बनाए रखे के मानल जाला ( 34 )। हालाँकि, दिमाग के ऊतक सभ खातिर एह तंत्र सभ के शारीरिक प्रासंगिकता (जहाँ धमनीकाठिन्य के मुख्य रूप से एस्ट्रोसाइट्स ले सीमित मानल जाला) के अबहिन ले महत्वपूर्ण शारीरिक महत्व बा ( 43 )। एह मामला में हमनी के आंकड़ा बतावेला कि शरीर में ऑक्सफोस से क्षतिग्रस्त पीएन के बीसीएए डिग्रेडेशन अवुरी पाइरुवेट कार्बोक्जिलेशन में बदलल जा सकता, जवन कि टीसीए पूल इंटरमीडिएट के पूरक के दुगो मुख्य स्रोत ह। हालाँकि, न्यूरॉनल ऊर्जा चयापचय में बीसीएए कैटाबोलिज्म के कथित योगदान के प्रस्ताव कइल गइल बा, न्यूरोट्रांसमिशन खातिर ग्लूटामेट आ जीएबीए के भूमिका के अलावा ( 44 ), इन विवो में एह तंत्र सभ के अबहिन ले कौनों सबूत नइखे मिलल। एह से ई अनुमान लगावल आसान बा कि बेकाम पीएन सभ धमनीकाठिन्य बढ़ा के आत्मसात प्रक्रिया से संचालित टीसीए इंटरमीडिएट सभ के खपत के भरपाई स्वचालित रूप से क सके लें। खासतौर पर, एस्पार्टिक एसिड के बढ़ल मांग के बनाए रखे खातिर पीसीएक्स के अपरेग्यूलेशन के जरूरत हो सके ला, जवन माइटोकॉन्ड्रिया डिसफंक्शन के साथ प्रजनन कोशिका सभ में देखावल गइल बा ( 45 )। हालांकि, हमनी के मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण से Mfn2cKO पीएन (चित्र S6A) में एस्पार्टिक एसिड के स्थिर-स्थिति स्तर में कवनो महत्वपूर्ण बदलाव ना भईल, जवन कि संभवतः प्रजनन कोशिका अवुरी पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स के बीच एस्पार्टिक एसिड के अलग-अलग चयापचय उपयोग के दर्शावता। हालांकि इन विवो में बेकाम न्यूरॉन में पीसीएक्स अपरेग्यूलेशन के सटीक तंत्र के विशेषता अभी बाकी बा, हमनी के इ देखवनी जा कि इ समय से पहिले प्रतिक्रिया न्यूरॉन के रेडॉक्स स्थिति के बनावे राखे में महत्वपूर्ण भूमिका निभावेला, जवना के सेरिबेलर स्लाइस प FLIM प्रयोग में देखावल गईल। खासतौर पर पीएन सभ के पीसीएक्स के अप-रेगुलेट करे से रोके से अउरी ऑक्सीडाइज्ड स्टेट हो सके ला आ कोशिका के मौत में तेजी आ सके ला। बीसीएए गिरावट के सक्रियण आ पाइरुवेट के कार्बोक्जिलेशन माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के परिधीय ऊतक सभ के बिसेसता बतावे के तरीका ना हवें ( 7 )। एह से ई ऑक्सफोस के कमी वाला न्यूरॉन सभ के प्राथमिकता वाला बिसेसता लउके लें, भले ई एकमात्र बिसेसता ना होखे, जवन न्यूरोडिजनरेशन खातिर महत्वपूर्ण होखे। .
सेरिबेलर बेमारी एगो बिसम प्रकार के न्यूरोडिजनरेटिव बेमारी हवे जे आमतौर पर अटैक्सिया के रूप में प्रकट होला आ अक्सर पीएन सभ के नुकसान पहुँचावे ला ( 46 )। ई न्यूरॉन आबादी माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के खासतौर पर कमजोर होले काहें से कि चूहा सभ में इनहन के चयनात्मक क्षय कई गो मोटर लच्छन सभ के दोबारा पैदा करे खातिर पर्याप्त होला जे मानव स्पाइनोसेरबेलर अटैक्सिया के बिसेसता हवें ( 16 , 47 , 48 )। रिपोर्ट सभ के अनुसार, उत्परिवर्तित जीन वाला ट्रांसजेनिक माउस मॉडल मानव स्पिनोसेरिबेलर अटैक्सिया से जुड़ल होला आ माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार होला ( 49 , 50 ), ई पीएनपीएच में ऑक्सफोस के कमी के परिणाम के अध्ययन के महत्व पर जोर देला। एह से ई खासतौर पर एह बिसेस न्यूरॉन आबादी के प्रभावी तरीका से अलग करे आ अध्ययन करे खातिर उपयुक्त बा। हालाँकि, ई देखत कि पीएन सभ दबाव के प्रति बहुत संवेदनशील होलें आ पूरा सेरिबेलर कोशिका आबादी के कम हिस्सा के हिस्सा होलें, कई ओमिक्स आधारित अध्ययन सभ खातिर, पूरा कोशिका के रूप में इनहन के चुनिंदा रूप से अलग कइल अबहिन ले एगो चुनौतीपूर्ण पहलू बाटे। हालांकि अन्य कोशिका प्रकार (खासकर वयस्क ऊतक) के संदूषण के बिल्कुल कमी हासिल कइल लगभग असंभव बा, हमनी के डाउनस्ट्रीम प्रोटीओमिक्स विश्लेषण खातिर पर्याप्त संख्या में व्यवहार्य न्यूरॉन प्राप्त करे खातिर FACS के साथ एगो प्रभावी विच्छेदन कदम के संयोजन कइनी जा, आ पूरा सेरिबैलम के मौजूदा डेटा सेट (51) के तुलना में काफी उच्च प्रोटीन कवरेज (लगभग 3000 प्रोटीन) बा। पूरा कोशिका के व्यवहार्यता के संरक्षित करके, हमनी के इहाँ उपलब्ध करावल तरीका हमनी के ना खाली माइटोकॉन्ड्रिया में चयापचय के रास्ता में बदलाव के जांच करे के अनुमति देला, बलुक एकरे साइटोप्लाज्मिक समकक्ष सभ में बदलाव के जांच करे के भी अनुमति देला, जवन कोशिका प्रकार खातिर बिसेस माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली लेबल संवर्धन के इस्तेमाल के पूरक होला जटिल ऊतक सभ में माइटोकॉन्ड्रिया के संख्या खातिर नया तरीका (52, 53)। हमनी के जवन तरीका के वर्णन कईले बानी जा, उ ना सिर्फ पुर्किन्जे कोशिका के अध्ययन से जुड़ल बा, बालुक एकरा के आसानी से कवनो प्रकार के कोशिका प लागू क के बेमारी से पीड़ित दिमाग में चयापचय के बदलाव के संबोधित कईल जा सकता, जवना में माइटोकॉन्ड्रिया के विकार के अवुरी मॉडल शामिल बा।
अंत में हमनी के एह मेटाबोलिक पुनर्व्यवस्था प्रक्रिया के दौरान एगो चिकित्सीय खिड़की के पहचान कईले बानी जा जवन कोशिका तनाव के प्रमुख संकेत के पूरा तरीका से उलट सकता अवुरी न्यूरॉनल क्षय के रोक सकता। एह से, इहाँ बतावल गइल रिवाइरिंग के कामकाजी निहितार्थ सभ के समझला से माइटोकॉन्ड्रिया के बिकार के दौरान न्यूरॉनल व्यवहार्यता के बनावे रखे खातिर संभावित उपचार सभ के बारे में मौलिक जानकारी मिल सके ला। भविष्य में होखे वाला शोध के जरूरत बा जवना के मकसद मस्तिष्क के अन्य कोशिका प्रकार में ऊर्जा चयापचय में बदलाव के विच्छेदन कईल बा, ताकि ए सिद्धांत के अवुरी न्यूरोलॉजिकल बेमारी प लागू होखे के पूरा तरीका से पता चल सके।
माइटोपार्क चूहा के वर्णन पहिले कइल गइल बा ( 31 )। loxP फ्लैंकिंग Mfn2 जीन वाला C57BL/6N चूहा सभ के पहिले वर्णन कइल गइल बा (18) आ L7-Cre चूहा सभ के साथ संकर कइल गइल बा (23)। एकरे बाद परिणामस्वरूप डबल हेटरोजाइगस संतान के होमोजाइगस Mfn2loxP/Mfn2loxP चूहा सभ के साथ क्रॉस क के Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) खातिर पुर्किन्जे-विशिष्ट जीन नॉकआउट पैदा कइल गइल। संभोग के एगो सबसेट में, Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP एलील (stop-mtYFP) के अतिरिक्त क्रॉस ( 20 ) के माध्यम से पेश कइल गइल। जानवरन के सगरी प्रक्रिया यूरोपीय, राष्ट्रीय आ संस्थागत दिशानिर्देश के अनुसार कइल गइल आ जर्मनी के उत्तरी राइन-वेस्टफेलिया के उमवेल्ट आ वर्ब्राउचरशुट्ज के लैंडसामटफुर्नचर द्वारा मंजूरी दिहल गइल। जानवरन के काम भी यूरोपीय फेडरेशन ऑफ लैबोरेटरी एनिमल साइंसेज एसोसिएशन के मार्गदर्शन के पालन करे ला।
गर्भवती महिला के गर्भाशय ग्रीवा के डिस्लोकेशन के बेहोश कईला के बाद माउस के भ्रूण के अलग कईल जाला (E13)। कॉर्टेक्स के 10 mM हेपेस के पूरक हैंक्स के बैलेंसड साल्ट सॉल्यूशन (HBSS) में विच्छेदन कइल गइल आ दुलबेको के मोडिफाइड ईगल के मीडियम पर पास कइल गइल जेह में पपेन (20 U/ml) आ सिस्टीन (1μg/ml) रहे। ऊतक के डीएमईएम में इन्क्यूबेट करीं) आ एंजाइमी पाचन से ओकरा के अलग करीं। Ml) 37°C पर 20 मिनट तक ले, आ फिर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के पूरक डीएमईएम में यांत्रिक रूप से मिलावल जाला। कोशिका सभ के इमेजिंग विश्लेषण खातिर 2×106 प्रति 6 सेमी कल्चर डिश के घनत्व पर या 0.5×105 कोशिका/सेमी2 के घनत्व पर पॉलीलाइसिन से लेपित कांच के कवरस्लिप पर बीज लगावल गइल। 4 घंटा के बाद, माध्यम के बदल के न्यूरोबेसल सीरम-फ्री मीडियम दिहल गईल जवना में 1% बी 27 सप्लीमेंट अवुरी 0.5 एमएम ग्लूटामैक्स रहे। एकरे बाद न्यूरॉन सभ के पूरा प्रयोग में 37°C आ 5% CO2 पर रखल गइल, आ हप्ता में एक बेर खियावल गइल। इन विट्रो में पुनर्संयोजन पैदा करे खातिर, इन विट्रो में दूसरा दिन न्यूरॉन सभ के इलाज खातिर निम्नलिखित AAV9 वायरस वेक्टर के 3μl (24-वेल कल्चर डिश) या 0.5μl (24-वेल प्लेट) के इस्तेमाल कइल गइल: AAV9.CMV.PI.eGFP। WPRE.bGH (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105530-AAV9) आ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (एडजीन, कैटलॉग नंबर 105545-AAV9)।
माउस Mfn1 आ Mfn2 पूरक डीएनए (क्रम से Addgene प्लाज्मिड #23212 आ #23213 से मिलल) के C-टर्मिनस पर V5 अनुक्रम (GKPIPNPLLGLDST) से चिन्हित कइल जाला, आ T2A अनुक्रम के माध्यम से फ्रेम में mCherry के साथ फ्यूज कइल जाला। Grx1-roGFP2 हाइडलबर्ग टीपी डिक डीएफकेजेड (ड्यूचेस क्रेब्सफोर्शंग्सजेनट्रम) के उपहार हवे। परंपरागत क्लोनिंग तरीका के इस्तेमाल से tdTomato कैसेट के बदल के, कैसेट के pAAV-CAG-FLEX-tdTomato बैकबोन (Addgene संदर्भ संख्या 28306) में सबक्लोन क के pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG- FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 आ... pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 वैक्टर के बा। नियंत्रण वेक्टर pAAV-CAG-FLEX-mCherry पैदा करे खातिर भी अइसने रणनीति के इस्तेमाल कइल गइल। एएवी-shPCx कंस्ट्रक्ट के जनरेट करे खातिर, एगो प्लाज्मिड एएवी वेक्टर (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) के जरूरत होला, जेह में माउस PCx (5′CTTTCGCTCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG) के निशाना बनावे वाला shRNA के एन्कोडिंग करे वाला डीएनए अनुक्रम होला 3′) U6 प्रोमोटर के नियंत्रण में, mCherry के इस्तेमाल सीएमवी प्रोमोटर के नियंत्रण में कईल जाला। सहायक एएवी वैक्टर के उत्पादन निर्माता के निर्देश (सेल बायोलैब्स) के अनुसार कइल गइल। संक्षेप में, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) के क्षणिक रूप से 293AAV कोशिका-T2A-MFN1-V5), mCherry के ट्रांसफेक्टेशन ले जाए वाला एगो ट्रांसफर प्लाज्मिड के इस्तेमाल करीं (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) या Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) कोडिंग जीन, साथ ही साथ AAV1 कैप्सिड प्रोटीन आ सहायक प्रोटीन पैकेजिंग प्लाज्मिड प्लाज्मिड के कोडिंग, कैल्शियम फॉस्फेट तरीका के इस्तेमाल से। कच्चा वायरस सुपरनेटेंट के सूखा बर्फ/इथेनॉल स्नान में फ्रीज-थॉ चक्र आ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में लाइज कइल कोशिका सभ के द्वारा प्राप्त कइल गइल। एएवी वेक्टर के असंतत आयोडिक्सानॉल ढाल अल्ट्रासेन्ट्रीफ्यूजेशन (32,000 आरपीएम आ 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटा) से शुद्ध कइल गइल आ एमिकॉन अल्ट्रा-15 सेंट्रीफ्यूगल फिल्टर के इस्तेमाल से गाढ़ कइल गइल। AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 जीनोम कॉपी (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG- FLEX के जीनोम टीटर पहिले बतावल गइल तरीका से रहे (54), रियल-टाइम मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) से नापल गइल। -MFN1-V5 (1.9×1013 जीसी/एमएल) आ एएवी1-सीएजी-फ्लेक्स-जीआरएक्स-रोजीएफपी2 (8.9×1012 जीसी/एमएल) के इस्तेमाल कइल जाला।
प्राथमिक न्यूरॉन सभ के बर्फ के ठंडा 1x पीबीएस में खुरच के हटा दिहल गइल, गोली बनावल गइल, आ फिर 0.5% ट्राइटन एक्स-100 / 0.5% सोडियम डिऑक्सीकोलेट/पीबीएस लाइसिस बफर में होमोजेनाइज कइल गइल जेह में फॉस्फेटेज आ प्रोटीज इनहिबिटर (रोचे) होखे। प्रोटीन के मात्रा निर्धारण बाइसिंकोनिनिक एसिड परख (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के उपयोग से कइल गइल। एकरे बाद प्रोटीन सभ के एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा अलग कइल गइल, आ फिर पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड झिल्ली (जीई हेल्थकेयर) पर ब्लॉट कइल गइल। गैर-विशिष्ट साइट सभ के ब्लॉक करीं आ टीबीएसटी (ट्वीन के साथ ट्रिस-बफर खारा), धोवे के स्टेप आ सेकेंडरी एंटीबॉडी में 5% दूध में प्राथमिक एंटीबॉडी (विस्तार से देखल जाय) के साथ इनक्यूबेट करीं इनक्यूबेट करीं। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर +4°C पर इन्क्यूबेट करीं। धोवे के बाद सेकेंडरी एंटीबॉडी के कमरा के तापमान प 2 घंटा तक लगावे के चाही। एकरे बाद, एकही ब्लॉट के एंटी-β-एक्टिन एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट क के, एकही लोडिंग के पुष्टि भइल। केमिलुमिनेसेंस में बदल के आ केमिलुमिनेसेंस (जीई हेल्थकेयर) बढ़ावे से पता लगावल।
ग्लास कवरस्लिप पर पहिले बीज लगावल न्यूरॉन सभ के 4% पैराफॉर्मलडीहाइड (PFA)/PBS से निर्धारित समय बिंदु पर कमरा के तापमान पर 10 मिनट ले फिक्स कइल गइल। कवरस्लिप सभ के पहिले 0.1% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस से कमरा के तापमान पर 5 मिनट ले, आ फिर ब्लॉकिंग बफर [3% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (BSA)/PBS] में घुसावल जाला। दूसरा दिन, कवरस्लिप सभ के ब्लॉकिंग बफर से धो के कमरा के तापमान पर 2 घंटा ले उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट कइल गइल; अंत में, नमूना सभ के 4′,6-डायमिडिनो-2 -फेनिलिंडोल (DAPI) के साथ पीबीएस में पूरा तरीका से धोवल गइल, काउंटरस्टेन कइल जाला आ फिर एक्वा-पॉली/माउंट के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर फिक्स कइल गइल।
चूहा (नर आ मादा) के केटामाइन (130 मिलीग्राम/किलोग्राम) आ ज़ाइलाजिन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन से बेहोश कइल गइल आ कार्प्रोफेन दर्द निवारक (5 मिलीग्राम/किलोग्राम) के साथ चमड़ी के नीचे दिहल गइल , आ गरम पैड से लैस स्टीरियोटैक्टिक उपकरण (Kopf) में रखल गइल। खोपड़ी के उजागर करीं आ दंत ड्रिल के इस्तेमाल से सेरिबेलर कॉर्टेक्स के मिस हड्डी के अनुरूप हिस्सा के पतला करीं (लैम्ब्डा से: पूंछ 1.8, लैटरल 1, लोब्यूल IV आ V के अनुरूप)। घुमावदार सिरिंज सुई के इस्तेमाल से खोपड़ी में सावधानी से एगो छोट छेद बनाईं ताकि नीचे के संवहनी तंत्र के बाधित ना होखे। एकरे बाद पतला खींचा कांच के केशिका के धीरे-धीरे माइक्रो-होल (ड्यूरा मेटर के उदर साइड पर -1.3 से -1 तक) में डालल जाला, आ 200 से 300 एनएल एएवी के माइक्रो-इंजेक्टर (नरिशिगे) में मैनुअल सिरिंज (नरिशिगे) के साथ कई बेर 10 से 20 मिनट के समय के अवधि में कम दबाव पर इंजेक्ट कइल जाला। इंफ्यूजन के बाद केशिका के 10 मिनट अउरी रख दीं ताकि वायरस पूरा तरीका से फइल सके। केशिका सभ के वापस ले लिहला के बाद त्वचा के सावधानी से सिवनी लगावल जाला ताकि घाव के सूजन कम से कम होखे आ जानवर के ठीक होखे के मौका मिले। ऑपरेशन के बाद कई दिन तक जानवर सभ के दर्द निवारक दवाई (कैस्पोफेन) से इलाज कइल गइल, एह दौरान इनहन के शारीरिक स्थिति के सावधानी से निगरानी कइल गइल आ फिर बतावल समय बिंदु पर इनहन के मृत्यदंड दिहल गइल। सभ प्रक्रिया यूरोपीय, राष्ट्रीय आ संस्थागत दिशानिर्देश के अनुसार कइल गइल आ जर्मनी के उत्तरी राइन-वेस्टफेलिया के उमवेल्ट आ वर्ब्राउचरशुट्ज के लैंडसामटफुरनाचर द्वारा मंजूरी दिहल गइल।
जानवर सभ के केटामाइन (100 मिलीग्राम/किलोग्राम) आ ज़ाइलाजिन (10 मिलीग्राम/किलोग्राम) से बेहोश कइल गइल, आ दिल के पहिले 0.1 एम पीबीएस से परफ्यूज कइल गइल, आ फिर पीबीएस में 4% पीएफए ​​के साथ। ऊतक के विच्छेदन कइल गइल आ 4% पीएफए/पीबीएस में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्स कइल गइल। पीबीएस में फिक्स दिमाग से सैजिटल सेक्शन (50 माइक्रोन मोटाई) तैयार करे खातिर वाइब्रेटिंग चाकू (लेइका माइक्रोसिस्टम्स जीएमबीएच, वियना, ऑस्ट्रिया) के इस्तेमाल कईल गईल। जब तक कि अन्यथा निर्दिष्ट ना कइल गइल होखे, मुक्त-फ्लोटिंग खंड सभ के धुंधलापन कमरा के तापमान आ हलचल पर ऊपर बतावल तरीका से (13) कइल गइल। संक्षेप में, पहिले, मिलल स्लाइस सभ के 0.5% ट्राइटन एक्स-100/पीबीएस के साथ कमरा के तापमान पर 15 मिनट ले पारगम्य बनावल गइल; कुछ एपिटोप (Pcx आ Shmt2) खातिर, द्वारा 80°C (PH 9) पर tris-EDTA बफर में एह स्टेप के बजाय 25 मिनट ले स्लाइस सभ के गरम करीं। एकरे बाद, खंड सभ के प्राथमिक एंटीबॉडी (देखीं तालिका S1) के साथ ब्लॉकिंग बफर (3% BSA/PBS) में 4°C पर रात भर हलचल के साथ इनक्यूबेट कइल गइल। अगिला दिने, खंड सभ के ब्लॉकिंग बफर से धो के उचित फ्लोरोफोर-संयुग्मित सेकेंडरी एंटीबॉडी के साथ कमरा के तापमान पर 2 घंटा ले इन्क्यूबेट कइल गइल; अंत में, खंड सभ के पीबीएस में बढ़िया से धो के डीएपीआई से काउंटर-स्टेन कइल गइल आ फिर एक्वापॉलीमाउंट ऑन माइक्रोस्कोप स्लाइड से फिक्स कइल गइल।
नमूना के इमेज बनावे खातिर लेजर स्कैनिंग कॉनफोकल माइक्रोस्कोप (TCS SP8-X या TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) के इस्तेमाल कइल गइल जे सफेद रोशनी लेजर आ 405 डायोड अल्ट्रावायलेट लेजर से लैस रहल। फ्लोरोफोर के उत्तेजित क के आ हाइब्रिड डिटेक्टर (HyDs) से सिग्नल के एकट्ठा क के, LAS-X सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल क्रमिक मोड में नाइकिस्ट सैंपलिंग के अनुरूप ढेर छवि सभ के एकट्ठा करे खातिर कइल गइल: गैर-मात्रा पैनल सभ खातिर, ई बहुत गतिशील सिग्नल हवे (उदाहरण खातिर, दैहिक कोशिका आ डेंड्राइट्स में) mtYFP) BrightR मोड में पीएन सभ के संख्या के पता लगावे खातिर HyD के इस्तेमाल करीं)। बैकग्राउंड कम करे खातिर 0.3 से 6 ns के गेटिंग लगावल जाला।
छाँटल कोशिका के रियल-टाइम इमेजिंग। 1% B27 पूरक आ 0.5 mM GlutaMax वाला न्यूरोबेसल-ए माध्यम में छँटाई के बाद, कोशिका सभ के तुरंत पॉली-एल-लाइसिन-लेपित ग्लास स्लाइड (μ-Slide8 Well, Ibidi, कैटलॉग नंबर 80826) पर बीज लगावल गइल , आ फिर एकरा के 37°C आ 5% CO2 पर 1 घंटा ले रखल गइल ताकि कोशिका सभ के बस जाए के मौका मिल सके। रियल-टाइम इमेजिंग लाइका SP8 लेजर स्कैनिंग कॉनफोकल माइक्रोस्कोप पर कइल गइल जे सफेद लेजर, HyD, 63×[1.4 न्यूमेरिकल एपर्चर (NA)] ऑयल ऑब्जेक्टिव लेंस आ हीटिंग स्टेज से लैस रहल।
माउस के जल्दी से कार्बन डाइऑक्साइड से बेहोश कर दिहल गइल आ सिर काट दिहल गइल, दिमाग के जल्दी से खोपड़ी से निकाल दिहल गइल, आ 200μm मोटाई (13C लेबलिंग प्रयोग खातिर) या 275μm मोटाई (दू गो फोटॉन प्रयोग खातिर) धनुषी खंड में काट के निम्नलिखित सामग्री से भरल आइसक्रीम (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) निम्नलिखित पदार्थ सभ से भरल होला: 125 mM बर्फ-ठंडा, कार्बन-संतृप्त (95% O2 आ 5% CO2) कम Ca2 + कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25 mM NaHCO3, 25 mM ग्लूकोज, 0.5 mM CaCl2 आ... 3.5 मिमी MgCl2 (310 से 330 मिलीमोल के आसमाटिक दबाव)। प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस के प्री-इन्क्यूबेशन कक्ष में स्थानांतरित करीं जवना में अधिक Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 आ 2.0 mM MgCl2) होखे। मध्यम) पीएच 7.4 आ 310 से 320 मिलीमोल) के होला।
इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान, स्लाइस सभ के एगो डेडिकेटेड इमेजिंग रूम में ले जाइल गइल, आ प्रयोग लगातार एसीएसएफ परफ्यूजन के तहत 32° से 33°C के लगातार तापमान पर कइल गइल। स्लाइस इमेजिंग खातिर मल्टीफोटन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) के इस्तेमाल कइल गइल जे लीका 25x ऑब्जेक्टिव लेंस (NA 0.95, पानी) से लैस रहल, Ti: नीलम लेजर (Chameleon Vision II, Coherent) के इस्तेमाल कइल गइल। एफएलआईएम मॉड्यूल (पिकोहार्प300, पिकोक्वांट) के बा।
Grx1-roGFP2 के FLIM के बा। पीएन सभ के साइटोप्लाज्मिक रेडॉक्स स्टेट में बदलाव के नापल सैजिटल ब्रेन स्लाइस सभ में दू-फोटॉन FLIM द्वारा कइल गइल, जहाँ Grx1-roGFP2 बायोसेंसर पीएन सभ के निशाना बनावे ला। पीएन परत में, स्लाइस सतह से लगभग 50 से 80 माइक्रोन नीचे अधिग्रहण क्षेत्र के चयन कइल जाला ताकि ई सुनिश्चित कइल जा सके कि एगो व्यवहार्य पीएन (अर्थात, डेंड्राइट्स के साथ मनका वाला संरचना भा न्यूरॉनल आकृति बिज्ञान के बदलाव के कमी) आ डबल पॉजिटिव roGFP2 सेंसर आ एएवी एन्कोडिंग shRNA PCx या एकरे नियंत्रण अनुक्रम (हर एक सह-एक्सप्रेसिंग mCherry) होखे। 2x डिजिटल जूम के साथ सिंगल-स्टैक इमेज एकट्ठा करीं [उत्तेजना तरंग दैर्ध्य: 890 एनएम; 512 एनएम 512 पिक्सेल के बा]। पता लगावल: आंतरिक HyD, फ्लोरोसेन आइसोथियोसाइनेट (FITC) फिल्टर समूह] आ 2 से 3 मिनट के भीतर इमेज औसतन के इस्तेमाल कइल जाला ताकि ई सुनिश्चित कइल जा सके कि वक्र फिटिंग खातिर पर्याप्त फोटॉन एकट्ठा होखे (कुल 1000 फोटॉन)। Grx1-roGFP2 जांच के संवेदनशीलता आ FLIM स्थिति सभ के सत्यापन roGFP2 के जीवनकाल मान के निगरानी से कइल गइल जब परफ्यूजन ACSF में बहिर्जात 10 mM H2O2 के जोड़े के काम कइल गइल (ऑक्सीडेशन के अधिकतम करे खातिर, जेकर परिणाम जीवनकाल में बढ़ती होला), आ फिर 2 mM डाइथियोथ्राइटोल के जोड़े के काम कइल गइल (कम करे के डिग्री कम हो जाला, परिणामस्वरूप कमी हो जाला जीवन काल में) (चित्र S8, डी से जी तक)। अर्जित परिणाम के विश्लेषण करे खातिर FLIMfit 5.1.1 सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल करीं, पूरा छवि के एकल घातीय क्षय वक्र के नापल गइल IRF (इंस्ट्रूमेंट रिस्पांस फंक्शन) में फिट करीं, आ χ2 लगभग 1 होला, एकही पीएन के जीवनकाल के गणना करे खातिर, तंत्रिका शरीर के आसपास के मास्क के मैन्युअल रूप से खींचल गइल, आ हर मास्क में औसत जीवनकाल के मात्रा निर्धारण खातिर इस्तेमाल कइल गइल।
माइटोकॉन्ड्रिया के संभावित विश्लेषण के बारे में बतावल गइल बा। तीव्र खंड के सीधे परफ्यूज कइल एसीएसएफ में जोड़े वाला 100 एनएम टीएमआरएम के साथ 30 मिनट तक इनक्यूबेट कइला के बाद, पीएन सभ के माइटोकॉन्ड्रिया बिभव बदलाव के दू-फोटॉन माइक्रोस्कोप से नापल गइल। टीएमआरएम इमेजिंग के जांच के 920 एनएम पर उत्तेजित क के आ सिग्नल एकट्ठा करे खातिर आंतरिक HyD (टेट्रामिथाइलरोडामाइन आइसोथियोसाइनेट: 585/40 एनएम) के इस्तेमाल से कइल गइल; एकही उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के इस्तेमाल से बाकी mtYFP के इमेज बनावे खातिर अलग आंतरिक HyD (FITC :525/50) के इस्तेमाल से। एकल कोशिका स्तर पर माइटोकॉन्ड्रिया क्षमता के मूल्यांकन करे खातिर इमेजजे के इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन के इस्तेमाल करीं। संक्षेप में, प्लग-इन समीकरण: सिग्नल = min (mtYFP, TMRM) के इस्तेमाल माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र के पहिचान करे खातिर कइल जाला जे संबंधित चैनल के सिंगल-स्टैक कॉनफोकल इमेज में पुर्किन्जे सोमाली में TMRM सिग्नल के देखावे ला। एकरे बाद परिणामस्वरूप मास्क में पिक्सेल क्षेत्र के मात्रा निर्धारित कइल जाला, आ फिर mtYFP चैनल के संबंधित थ्रेसहोल्ड सिंगल-स्टैक इमेज पर नॉर्मलाइज कइल जाला ताकि माइटोकॉन्ड्रिया के पोटेंशियल देखावे वाला माइटोकॉन्ड्रिया के हिस्सा मिल सके।
छवि के ह्यूजेंस प्रो (साइंटिफिक वॉल्यूम इमेजिंग) सॉफ्टवेयर से डिकॉन्वोल्यूट कइल गइल। टाइल्स के स्कैन कइल तस्वीर खातिर, एकही टाइल के मोंटाज लास-एक्स सॉफ्टवेयर द्वारा दिहल गइल ऑटोमैटिक सिलाई एल्गोरिदम के इस्तेमाल से कइल जाला। इमेज कैलिब्रेशन के बाद इमेजजे अवुरी एडोब फोटोशॉप के इस्तेमाल क के इमेज के अवुरी प्रोसेस कईल जा सकता अवुरी एक समान रूप से ब्राइटनेस अवुरी कंट्रास्ट के एडजस्ट कईल जा सकता। ग्राफिक तैयारी खातिर एडोब इलस्ट्रेटर के इस्तेमाल करीं।
mtDNA फोकस विश्लेषण के बारे में बतावल गइल बा। mtDNA घाव के संख्या के मात्रा कॉनफोकल माइक्रोस्कोप से डीएनए के खिलाफ एंटीबॉडी से लेबल कइल सेरिबेलर सेक्शन पर कइल गइल। हर लक्ष्य क्षेत्र के कोशिका शरीर आ हर कोशिका के नाभिक खातिर बनावल गइल आ मल्टी मेजर प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेयर) के इस्तेमाल से संबंधित क्षेत्र के गणना कइल गइल। कोशिका शरीर के क्षेत्रफल से नाभिकीय क्षेत्र घटा के कोशिका द्रव्य क्षेत्र प्राप्त करीं। अंत में, एनालाइज पार्टिकल्स प्लग-इन (इमेजजे सॉफ्टवेयर) के इस्तेमाल थ्रेसहोल्ड इमेज पर mtDNA के संकेत देवे वाला साइटोप्लाज्मिक डीएनए बिंदु सभ के स्वचालित रूप से मात्रा निर्धारित करे खातिर कइल गइल आ मिलल परिणाम सभ के सीटीआरएल चूहा सभ के पीएन औसत पर सामान्य कइल गइल। परिणाम के प्रति कोशिका न्यूक्लियोसाइड के औसत संख्या के रूप में बतावल जाला।
प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के बारे में बतावल गइल बा। एकल कोशिका स्तर पर पीएन में प्रोटीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन करे खातिर इमेजजे के इमेज कैलकुलेटर प्लग-इन के इस्तेमाल करीं। संछेप में, संबंधित चैनल के सिंगल-लेयर कॉनफोकल इमेज में, समीकरण: सिग्नल = min (mtYFP, एंटीबॉडी) के माध्यम से, माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्र के पहिचान कइल जाला जे पुर्किना में कौनों खास एंटीबॉडी के प्रति इम्यूनोरिएक्टिविटी देखावे ला। एकरे बाद परिणामस्वरूप मास्क में पिक्सेल क्षेत्र के मात्रा निर्धारित कइल जाला, आ फिर mtYFP चैनल के संबंधित थ्रेसहोल्ड सिंगल-स्टैक इमेज पर नॉर्मलाइज कइल जाला ताकि प्रदर्शित प्रोटीन के माइटोकॉन्ड्रिया अंश प्राप्त कइल जा सके।
पुर्किन्जे कोशिका घनत्व विश्लेषण के बा। इमेजजे के सेल काउंटर प्लग-इन के इस्तेमाल पुर्किन्जे घनत्व के मूल्यांकन करे खातिर कइल गइल आ गिनल गइल कोशिका सभ द्वारा कब्जा कइल गइल सेरिबेलर रिंग के लंबाई से गिनल गइल पुर्किन्जे कोशिका सभ के संख्या के भाग दिहल गइल।
नमूना के तइयारी आ संग्रहण के काम। नियंत्रण समूह आ Mfn2cKO चूहा सभ के दिमाग के 0.1 M फॉस्फेट बफर (PB) में 2% PFA/2.5% ग्लूटारएलडीहाइड में फिक्स कइल गइल, आ फिर कोरोनल सेक्शन सभ के सिलिएट्स (Leica Mikrosysteme GmbH, वियना, ऑस्ट्रिया) (मोटाई 50 से 60 μm) के इस्तेमाल से तइयार कइल गइल फिर 1% os टेट्राऑक्साइड में PB बफर में फिक्स कइल गइल आ... 1.5% पोटेशियम फेरोसायनाइड कमरा के तापमान पर 1 घंटा तक। खंड सभ के आसुत पानी से तीन बेर धोवल गइल, आ फिर 1% यूरेनाइल एसीटेट वाला 70% इथेनॉल से 20 मिनट ले रंगल गइल। एकरे बाद एह खंड सभ के ग्रेड कइल अल्कोहल में निर्जलीकरण कइल गइल आ सिलिकॉन लेपित ग्लास स्लाइड सभ के बीच दुरकुपन एसीएम (अराल्डाइट कास्टिंग रेजिन एम) इपोक्सी राल (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी साइंसेज, कैटलॉग नंबर 14040) में एम्बेड कइल गइल आ अंत में 60°C पर ओवन में 48 घंटा ले पॉलीमाइज कइल गइल। सेरिबेलर कॉर्टेक्स क्षेत्र के चयन कइल गइल आ लीका अल्ट्राकट (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) पर 50 एनएम अल्ट्राथिन सेक्शन के काट के पॉलीस्टायरीन फिल्म से लेपित 2×1 मिमी तांबा के स्लिट ग्रिड पर चुनल गइल। खंड सभ के H2O में 4% यूरेनाइल एसीटेट के घोल से 10 मिनट ले रंगाई कइल गइल, H2O से कई बेर धोवल गइल, फिर H2O में रेनॉल्ड्स सीसा साइट्रेट से 10 मिनट ले धोवल गइल आ फिर H2O से कई बेर धोवल गइल। माइक्रोग्राफ सभ के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप फिलिप्स सीएम100 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वाल्थम, एमए, अमेरिका) से टीवीआईपीएस (टिएट्ज वीडियो एंड इमेज प्रोसेसिंग सिस्टम) टेमकैम-एफ416 डिजिटल कैमरा (टीवीआईपीएस जीएमबीएच, गॉटिंग, अमेरिका) के इस्तेमाल से लिहल गइल। जर्मनी के बा)।
एएवी से संक्रमित चूहा सभ खातिर दिमाग के अलग क के 1 मिमी मोटाई के सैजिटल सेक्शन में काट दिहल गइल आ एएवी से संक्रमित रिंग (अर्थात mCherry एक्सप्रेसिंग) के पहिचान करे खातिर फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल से सेरिबैलम के जांच कइल गइल। खाली अइसन प्रयोग सभ के इस्तेमाल कइल जाला जिनहन में एएवी इंजेक्शन के परिणामस्वरूप कम से कम दू गो लगातार सेरिबेलर रिंग सभ में पुर्किन्जे कोशिका परत (अर्थात लगभग पूरा परत) के बहुत ढेर ट्रांसडक्शन दक्षता होखे। एएवी-ट्रांसड्यूस्ड लूप के रात भर पोस्ट-फिक्सेशन (0.1 एम कोकोएट बफर में 4% पीएफए ​​आ 2.5% ग्लूटारएलडीहाइड) खातिर माइक्रोडिसेक्टेड कइल गइल आ आगे प्रोसेस कइल गइल। ईपीओएन एम्बेडिंग खातिर, फिक्स ऊतक के 0.1 एम सोडियम कोकोएट बफर (एप्लिकेम) से धोवल गइल, आ 0.1 एम सोडियम कोकोएट बफर (एप्लीचेम) ​​में 2% OsO4 (os, साइंस सर्विसेज; काको) के साथ 4 घंटा इन्क्यूबेट कइल गइल, फिर 2 घंटा ले धोवल गइल। 0.1 एम कोकामाइड बफर के साथ 3 बार दोहराएं। एकरे बाद, इथेनॉल के आरोही श्रृंखला के इस्तेमाल हर इथेनॉल घोल के 4°C पर 15 मिनट ले इन्क्यूबेट करे खातिर कइल गइल ताकि ऊतक के निर्जलीकरण कइल जा सके। ऊतक के प्रोपलीन ऑक्साइड में स्थानांतरित कइल गइल आ रात भर ईपीएन (सिग्मा-एल्ड्रिच) में 4°C पर इन्क्यूबेट कइल गइल। ऊतक के कमरा के तापमान पर ताजा ईपीएन में 2 घंटा तक रखीं, आ ओकरा बाद 62 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटा तक एम्बेड करीं। अल्ट्रामाइक्रोटोम (Leica Microsystems, UC6) आ हीरा के चाकू (Diatome, Biel, Switzerland) के इस्तेमाल से 70 nm के अल्ट्राथिन सेक्शन काट लीं, आ 1.5% यूरेनाइल एसीटेट से 37°C पर 15 मिनट ले दाग लगाईं, आ सीसा साइट्रेट घोल से 4 मिनट ले दाग दीं। इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ कैमरा वनव्यू 4K 16-बिट (गटन) आ डिजिटलमाइक्रोग्राफ सॉफ्टवेयर (गटन) से लैस जेईएम-2100 प्लस ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (JEOL) के इस्तेमाल से लिहल गइल। विश्लेषण खातिर इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ के 5000× या 10,000× डिजिटल जूम के साथ हासिल कइल गइल।
माइटोकॉन्ड्रिया के आकृति विज्ञान के विश्लेषण। सभ विश्लेषण सभ खातिर, अलग-अलग माइटोकॉन्ड्रिया के समोच्च के मैन्युअल रूप से इमेजजे सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल से डिजिटल इमेज में रेखांकित कइल गइल। अलग-अलग रूपात्मक पैरामीटर के विश्लेषण कइल जाला। माइटोकॉन्ड्रिया घनत्व के हर कोशिका के कुल माइटोकॉन्ड्रिया क्षेत्रफल के कोशिका द्रव्य क्षेत्र (साइटोप्लाज्म क्षेत्र = कोशिका क्षेत्र-कोशिका नाभिक क्षेत्र) × 100 से भाग देके मिलल प्रतिशत के रूप में बतावल जाला।माइटोकॉन्ड्रिया के गोलाई के गणना सूत्र [4π∙(क्षेत्रफल/परिधि 2)] से कइल जाला। माइटोकॉन्ड्रिया के इस्टा आकृति बिज्ञान के बिस्लेषण कइल गइल आ इनहन के मुख्य आकृति के हिसाब से दू गो श्रेणी (“ट्यूबुलर" आ "फफोला") में बाँटल गइल।
ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संख्या आ घनत्व के विश्लेषण। डिजिटल इमेज में हर ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम के समोच्च के मैन्युअल रूप से रेखांकित करे खातिर इमेजजे सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल करीं। ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम क्षेत्रफल के प्रतिशत के रूप में बतावल जाला जेकर गणना हर कोशिका के कुल ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचना क्षेत्रफल के कोशिका द्रव्य क्षेत्र (साइटोप्लाज्म क्षेत्र=कोशिका क्षेत्र-नाभिक क्षेत्र)×100 से भाग दे के कइल जाला। ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम सभ के घनत्व के गणना कुल संख्या के प्रति कोशिका ऑटोफेगोसोम/लाइसोसोम संरचना सभ के संख्या (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रफल के हिसाब से) (साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रफल = कोशिका क्षेत्र-नाभिकीय क्षेत्र) से भाग दे के कइल जाला।
तीव्र खंडन आ नमूना तइयारी खातिर लेबलिंग। अइसन प्रयोग सभ खातिर जेह में ग्लूकोज लेबलिंग के जरूरत होखे, तीव्र दिमाग के स्लाइस सभ के प्री-इन्क्यूबेशन चैम्बर में स्थानांतरित करीं, जेह में संतृप्त कार्बन (95% O2 आ 5% CO2), हाई Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO 3, 25.0 mM होला d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl 2 आ 2.0 mM MgCl 2, pH 7.4 आ 310 से 320 mOsm पर समायोजित), जवना में ग्लूकोज 13 C 6- ग्लूकोज प्रतिस्थापन (Eurisotop, कैटलॉग नंबर CLM-1396) होला। अइसन प्रयोग सभ खातिर जवना में पाइरुवेट लेबलिंग के जरूरत होखे, तीव्र दिमाग के स्लाइस सभ के उच्च Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 आ 2.0mM डालल जाय) में स्थानांतरित करीं MgCl2, pH 7.4 आ 310 से 320mOsm पर समायोजित करीं, आ 1mM 1-[1-13C]पाइरुवेट (Eurisotop, कैटलॉग नंबर CLM-1082) डाल दीं। खंडन के 37 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट तक इन्क्यूबेट करीं। प्रयोग के अंत में, खंड सभ के जल्दी से 75 mM अमोनियम कार्बोनेट वाला जलीय घोल (pH 7.4) से धो दिहल गइल, आ फिर 40:40:20 (v:v:v) एसीटोनिट्राइल (ACN): मेथनॉल: पानी में होमोजीनाइज कइल गइल। खंड सभ के बर्फ पर 30 मिनट ले इन्क्यूबेट कइला के बाद, नमूना सभ के 21,000 ग्राम पर 4°C पर 10 मिनट ले सेंट्रीफ्यूज कइल गइल आ साफ सुपरनेटेंट के स्पीडवैक कंसेन्ट्रेटर में सुखावल गइल। परिणामस्वरूप सूखल मेटाबोलाइट गोली के विश्लेषण तक -80°C पर संग्रहीत कइल गइल।
13 सी-लेबल अमीनो एसिड के तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण। लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) विश्लेषण खातिर, मेटाबोलाइट गोली के 75μl एलसी-एमएस ग्रेड पानी (हनीवेल) में फिर से लटका दिहल गइल। 4°C पर 21,000 g पर 5 मिनट ले सेंट्रीफ्यूज कइला के बाद, 20 μl के क्लियर कइल सुपरनेटेंट के इस्तेमाल अमीनो एसिड फ्लक्स बिस्लेषण खातिर कइल गइल जबकि बाकी अर्क के तुरंत आयन बिस्लेषण खातिर इस्तेमाल कइल गइल (नीचे देखल जाय)। अमीनो एसिड विश्लेषण पहिले वर्णित बेंजोइल क्लोराइड व्युत्पन्नीकरण प्रोटोकॉल ( 55 , 56 ) के उपयोग से कइल गइल। पहिला चरण में, 10μl 100 mM सोडियम कार्बोनेट (सिग्मा-एल्ड्रिच) के 20μl मेटाबोलाइट अर्क में मिलावल गइल, आ फिर 10μl 2% बेंजोइल क्लोराइड (सिग्मा-एल्ड्रिच) के एलसी ग्रेड ACN में मिलावल गइल। नमूना के कुछ समय खातिर भंवर कइल गइल आ फिर 21,000 ग्राम पर 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट ले सेंट्रीफ्यूज कइल गइल। साफ सुपरनेटेंट के शंक्वाकार ग्लास इन्सर्ट (200 μl वॉल्यूम) के साथ 2 मिलीलीटर ऑटोसैंपलर शीशी में स्थानांतरित करीं। नमूना सभ के बिस्लेषण क्यू-एक्सएक्टिव (क्यूई)-एचएफ (अल्ट्रा हाई फील्ड ऑर्बिट्रैप) हाई-रिजोल्यूशन परिशुद्धता मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से जुड़ल एक्विटी आईक्लास अल्ट्रा-हाई परफॉर्मेंस एलसी सिस्टम (वाटर्स) के इस्तेमाल से कइल गइल। विश्लेषण खातिर, व्युत्पन्न नमूना के 2μl के 100×1.0 मिमी उच्च ताकत वाला सिलिका T3 कॉलम (पानी) में इंजेक्ट कइल गइल जेह में 1.8μm कण रहलें। प्रवाह दर 100μl/min होला आ बफर सिस्टम में बफर ए (पानी में 10 mM अमोनियम फॉर्मेट आ 0.15% फॉर्मिक एसिड) आ बफर बी (ACN) होला। ढाल निम्नलिखित बा: 0 मिनट पर 0%B; 0%बी के बा। 0 से 0.1 मिनट पर 0 से 15% बी के होला; 0.1 से 0.5 मिनट पर 15 से 17% बी के होला; बी 0.5 से 14 मिनट पर 17 से 55% पर; बी 14 से 14.5 मिनट पर 55 से 70% पर; 18 मिनट में 14.5 से 70 से 100% बी पर; 18 से 19 मिनट में 100% बी के बा; 19 से 19.1 मिनट में 100 से 0% बी; 19.1 से 28 मिनट (55, 56) पर 0% बी के बा। QE-HF मास स्पेक्ट्रोमीटर पॉजिटिव आयनीकरण मोड में काम करे ला आ एकर मास रेंज m/z (मास/चार्ज रेशियो) 50 से 750 होला, लागू रिजोल्यूशन 60,000 होला, आ मिलल गेन कंट्रोल (AGC) आयन टारगेट 3×106 होला, आ अधिकतम आयन समय 100 मिलीसेकंड होला। गरम इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) स्रोत 3.5 केवी के स्प्रे वोल्टेज, 250°C के केशिका तापमान, 60 AU (मनमानी इकाई) के म्यान हवा के प्रवाह आ 20 AU के सहायक हवा के प्रवाह पर काम करे ला। 250 डिग्री सेल्सियस के बा। एस लेंस के 60 एयू प सेट कईल गईल बा।
13C लेबल कार्बनिक अम्ल के आयन क्रोमैटोग्राफी-एमएस विश्लेषण। बाकी मेटाबोलाइट अवक्षेप (55μl) के विश्लेषण डायोनेक्स आयन क्रोमैटोग्राफी सिस्टम (ICS 5000+, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के इस्तेमाल से कइल गइल जे क्यूई-एचएफ मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) से जुड़ल रहल। संक्षेप में, 5μl मेटाबोलाइट अर्क के 1. )on के भरने के अनुपात के साथ पुश-इन आंशिक लूप मोड में एचपीएलसी (2 मिमी × 250 मिमी, कण आकार 4μm, थर्मो फिशर साइंटिफिक) से लैस डायोनेक्स आयनपैक AS11-HC कॉलम में इंजेक्ट कइल गइल। डायोनेक्स आयनपैक एजी11-एचसी गार्ड कॉलम (2 मिमी x 50 मिमी, 4 माइक्रोन, थर्मो फिशर साइंटिफिक)। कॉलम के तापमान 30°C पर रखल जाला, आ ऑटोसैंपलर के 6°C पर सेट कइल जाला। इल्यूएंट जनरेटर के माध्यम से पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड ढाल पैदा करे खातिर विआयनीकृत पानी के साथ दिहल गइल पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड कारतूस के इस्तेमाल करीं। 380μl/min के प्रवाह दर पर मेटाबोलाइट्स के अलगाव, निम्नलिखित ढाल लागू कइल: 0 से 3 मिनट, 10 mM KOH; 3 से 12 मिनट, 10 से 50 मिमी केओएच; 12 से 19 मिनट, 50 से 100 मिमी केओएच; 19 से 21 मिनट , 100 मिमी केओएच के बा; 21 से 21.5 मिनट, 100 से 10 मिमी केओएच के बा। कॉलम के 10 एमएम KOH के तहत 8.5 मिनट तक फिर से संतुलित कइल गइल।
इल्यूट भइल मेटाबोलाइट्स सभ के कॉलम के बाद 150μl/min आइसोप्रोपानोल सप्लीमेंट स्ट्रीम के साथ जोड़ल जाला आ फिर नेगेटिव आयनीकरण मोड में काम करे वाला हाई-रिजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमीटर के ओर निर्देशित कइल जाला। एमएस 60,000 के रिजोल्यूशन के संगे m/z 50 से 750 तक के द्रव्यमान रेंज के निगरानी कर रहल बा। एजीसी के 1×106 पर सेट कइल गइल बा, आ अधिकतम आयन समय 100 एमएस पर रखल गइल बा। गरम ईएसआई स्रोत के 3.5 केवी के स्प्रे वोल्टेज पर संचालित कइल गइल। आयन स्रोत के अन्य सेटिंग सभ निम्नलिखित बाड़ी सऽ: केशिका तापमान 275°C; म्यान गैस के प्रवाह, 60 एयू के बा; सहायक गैस के प्रवाह, 300°C पर 20 AU, आ S लेंस 60 AU पर सेट कइल जाला।
13C लेबल मेटाबोलाइट्स के डेटा विश्लेषण। आइसोटोप अनुपात के डेटा विश्लेषण खातिर ट्रेसफाइंडर सॉफ्टवेयर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के इस्तेमाल करीं। हर यौगिक के पहचान के सत्यापन एगो विश्वसनीय संदर्भ यौगिक द्वारा कइल गइल आ स्वतंत्र रूप से विश्लेषण कइल गइल। आइसोटोप संवर्धन बिस्लेषण करे खातिर हर 13C आइसोटोप (Mn) के निकालल आयन क्रोमैटोग्राम (XIC) के क्षेत्रफल [M + H] + से निकालल गइल, जहाँ n लक्ष्य यौगिक के कार्बन संख्या हवे, जेकर इस्तेमाल अमीनो एसिड सभ के बिस्लेषण करे खातिर कइल जाला या [ MH] + के इस्तेमाल आयन सभ के बिस्लेषण करे खातिर कइल जाला। एक्सआईसी के द्रव्यमान सटीकता पांच भाग प्रति मिलियन से कम बा, आ आरटी के सटीकता 0.05 मिनट बा। संवर्धन विश्लेषण हर पता चलल आइसोटोप के अनुपात के गणना क के कइल जाला आ संबंधित यौगिक के सभ आइसोटोप सभ के योग से कइल जाला। ई अनुपात हर आइसोटोप खातिर प्रतिशत मान के रूप में दिहल गइल बा, आ परिणाम मोलर प्रतिशत संवर्धन (MPE) के रूप में बतावल गइल बा, जइसन कि पहिले बतावल गइल बा (42)।
जमल न्यूरॉन गोली के बर्फ के ठंडा 80% मेथनॉल (v/v) में होमोजीनाइज कइल गइल, भंवर कइल गइल आ -20°C पर 30 मिनट ले इन्क्यूबेट कइल गइल। नमूना के फिर से भंवर बना के +4°C पर 30 मिनट तक हिलावे के चाहीं। नमूना के 21,000 ग्राम पर 4°C पर 5 मिनट ले सेंट्रीफ्यूज कइल गइल, आ फिर परिणामस्वरूप सुपरनेटेंट के एकट्ठा कइल गइल आ बाद के बिस्लेषण खातिर 25°C पर स्पीडवैक कंसेन्ट्रेटर के इस्तेमाल से सुखावल गइल। जइसन कि ऊपर बतावल गइल बा, छँटाईल कोशिका के अमीनो एसिड पर एलसी-एमएस विश्लेषण कइल गइल। ट्रेसफाइंडर (संस्करण 4.2, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के इस्तेमाल से, हर यौगिक के मोनोआइसोटोपिक द्रब्यमान के इस्तेमाल से डेटा बिस्लेषण कइल गइल। मेटाबोलाइट डेटा के क्वांटाइल सामान्यीकरण preprocessCore सॉफ्टवेयर पैकेज ( 57 ) के उपयोग से कइल गइल।
स्लाइस के तइयारी के काम हो रहल बा। माउस के जल्दी से कार्बन डाइऑक्साइड से बेहोश क के सिर काट दिहल गइल, दिमाग के जल्दी से खोपड़ी से निकाल दिहल गइल आ बर्फ से भरल कंपन चाकू (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) के इस्तेमाल से एकरा के 300 से 375 μm धनुषी खंड में काट दिहल गइल ठंडा कार्बन गैसीकरण (95% O2 आ 5% CO2) कम Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 1.0 mM CaCl2 आ 6.0 mM MgCl2 पीएच 7.4 आ 310 से 330 mOsm पर समायोजित करीं)। प्राप्त मस्तिष्क स्लाइस के एगो कक्ष में स्थानांतरित करीं जवना में अधिक Ca2 + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM सोडियम फॉस्फेट बफर, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-ग्लूकोज, 4.0 mM CaCl2 आ mM 3.5 MgCl2) pH 7.4 आ... 310 से 320 एमओएसएम तक के बा)। स्लाइस के 20 से 30 मिनट तक स्टोर करीं ताकि रिकॉर्डिंग से पहिले एकरा के बहाल कईल जा सके।
रिकार्डिंग के काम हो रहल बा. सभ रिकार्डिंग खातिर एगो फिक्स्ड रिकार्डिंग चैम्बर आ 20x वाटर इमर्सन ऑब्जेक्टिव लेंस (साइंटिफिका) से लैस माइक्रोस्कोप स्टेज के इस्तेमाल कइल गइल। कथित पुर्किन्जे कोशिका सभ के पहिचान (i) शरीर के आकार, (ii) सेरिबैलम के एनाटोमिकल लोकेशन, आ (iii) फ्लोरोसेंट mtYFP रिपोर्टर जीन के एक्सप्रेशन से कइल गइल। 5 से 11 मेगोहम के टिप रेजिस्टेंस वाला पैच पिपेट के बोरोसिलिकेट ग्लास केशिका (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, साइंस प्रोडक्ट्स, होफहेम, जर्मनी) आ एगो क्षैतिज पिपेट इंस्ट्रूमेंट्स (P-1000, Sutter), नोवाटो, सीए द्वारा बाहर निकालल जाला। सभ रिकार्डिंग ELC-03XS npi पैच क्लैंप एम्पलीफायर (npi electronic GmbH, Tam, Germany) द्वारा कइल गइल, जेकरा के सॉफ्टवेयर सिग्नल (संस्करण 6.0, कैम्ब्रिज इलेक्ट्रॉनिक, कैम्ब्रिज, यूके) द्वारा नियंत्रित कइल गइल। प्रयोग के 12.5 किलोहर्ट्ज के नमूना दर से रिकॉर्ड कईल गईल। सिग्नल के दू गो शॉर्ट-पास बेसल फिल्टर से फिल्टर कइल जाला जेकर कटऑफ फ्रीक्वेंसी क्रमशः 1.3 आ 10 किलोहर्ट्ज होला। झिल्ली आ पिपेट के समाई के भरपाई एम्पलीफायर के इस्तेमाल से कम्पेंसेशन सर्किट द्वारा कइल जाला। सभ प्रयोग ओर्का-फ्लैश 4.0 कैमरा (हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) के नियंत्रण में कइल गइल, जेकरा के होकावो सॉफ्टवेयर (संस्करण 2.8, हमामात्सु, गेर्डन, जर्मनी) द्वारा नियंत्रित कइल गइल।
नियमित रूप से पूरा कोशिका के विन्यास आ विश्लेषण। रिकार्डिंग से ठीक पहिले पिपेट में आंतरिक घोल भरीं जवना में निम्नलिखित पदार्थ होखे: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM पोटेशियम ग्लूकोनेट, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM Guanosine ट्राइफॉस्फेट (GTP) (Na) आ 10.0 mM क्रिएटिनिन फॉस्फेट के पीएच 7.25 तक समायोजित कइल गइल, आ आसमाटिक दबाव 290 mOsm (सुक्रोज) रहल। झिल्ली के फाड़े खातिर 0 pA के बल लगावे के तुरंत बाद आराम करे वाली झिल्ली के क्षमता के नापल गइल। इनपुट रेजिस्टेंस के माप -40, -30, -20, आ -10 pA के हाइपरपोलराइज्ड करंट लगा के कइल जाला। वोल्टेज रिस्पांस के परिमाण नाप के इनपुट रेजिस्टेंस के गणना करे खातिर ओम के नियम के इस्तेमाल करीं। स्वतःस्फूर्त गतिविधि के 5 मिनट ले वोल्टेज क्लैंप में रिकार्ड कइल गइल, आ अर्ध-स्वचालित पहचान स्क्रिप्ट के इस्तेमाल से इगोर प्रो (संस्करण 32 7.01, वेवमेट्रिक्स, लेक ओस्वेगो, ओरेगन, अमेरिका) में sPSC के पहिचान आ नापजोख कइल गइल। IV कर्व आ स्टेडी-स्टेट करंट के नापजोख बैटरी के अलग-अलग पोटेंशियल (-110 mV से शुरू) पर क्लैंप क के आ 5 mV स्टेप में वोल्टेज बढ़ा के कइल जाला। एपी के उत्पादन के परीक्षण डिपोलराइजिंग करंट लगा के कइल गइल। डिपोलराइजिंग करंट पल्स लगावत घरी सेल के -70 एमवी पर क्लैंप करीं। हर रिकार्डिंग यूनिट के स्टेप साइज के अलग-अलग (10 से 60 पीए) समायोजित करीं। पल्स स्पाइक के मैन्युअल रूप से गिनती करके अधिकतम एपी आवृत्ति के गणना करीं जवना से सबसे अधिका एपी आवृत्ति होला। एपी थ्रेसहोल्ड के बिस्लेषण डिपोलराइजेशन पल्स के दूसरा डेरिवेटिव के इस्तेमाल से कइल जाला जे पहिले एक या एक से ढेर एपी सभ के ट्रिगर करे ला।
छेद वाला पैच कॉन्फ़िगरेशन आ विश्लेषण। मानक प्रोटोकॉल के उपयोग से छिद्रित पैच रिकॉर्डिंग करीं। एटीपी- आ जीटीपी-फ्री पिपेट के इस्तेमाल करीं जेह में निम्नलिखित सामग्री ना होखे: 128 mM ग्लूकोनेट के, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA आ 2 mM MgCl2, आ pH 7.2 (KOH के इस्तेमाल से) पर समायोजित करीं। कोशिका झिल्ली के अनियंत्रित पारगम्यता के रोके खातिर अंतःकोशिकीय घोल से एटीपी आ जीटीपी के छोड़ दिहल जाला। पैच पिपेट में एम्फोटेरिसिन युक्त आंतरिक घोल (लगभग 200 से 250 μg/ml; G4888, सिग्मा-एल्ड्रिच) भरल जाला ताकि छिद्रित पैच के रिकार्ड मिल सके। एम्फोटेरिसिन के डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (अंतिम एकाग्रता: 0.1 से 0.3%; डीएमएसओ; डी8418, सिग्मा-एल्ड्रिच) में घोल दिहल गइल। इस्तेमाल कइल गइल डीएमएसओ के एकाग्रता के अध्ययन कइल न्यूरॉन पर कवनो खास असर ना पड़ल. पंचिंग प्रक्रिया के दौरान चैनल रेजिस्टेंस (Ra) के लगातार निगरानी कइल गइल, आ Ra आ AP के आयाम स्थिर भइला के बाद (20-40 मिनट) प्रयोग शुरू कइल गइल। स्वतःस्फूर्त गतिविधि के वोल्टेज आ/या करंट क्लैंप में 2 से 5 मिनट तक नापल जाला। डेटा के बिस्लेषण इगोर प्रो (संस्करण 7.05.2, वेवमेट्रिक्स, अमेरिका), एक्सेल (संस्करण 2010, माइक्रोसॉफ्ट कॉर्पोरेशन, रेडमंड, अमेरिका) आ ग्राफपैड प्रिज्म (संस्करण 8.1.2, ग्राफपैड सॉफ्टवेयर इंक, ला जोला, सीए) के इस्तेमाल से कइल गइल। अमेरिका के ह)। सहज एपी के पहचान करे खातिर इगोरप्रो के न्यूरोमैटिक v3.0c प्लग-इन के इस्तेमाल कईल जाला। कवनो दिहल थ्रेसहोल्ड के इस्तेमाल से एपी के स्वचालित रूप से पहचान करीं, जवना के हर रिकार्ड खातिर अलग-अलग समायोजित कइल जाला। स्पाइक अंतराल के इस्तेमाल से अधिकतम तात्कालिक स्पाइक आवृत्ति आ औसत स्पाइक आवृत्ति के साथ स्पाइक आवृत्ति के निर्धारण करीं।
पीएन आइसोलेशन के बा। पहिले प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुकूल होके, पीएन के एगो निर्दिष्ट चरण में माउस सेरिबैलम से शुद्ध कईल गईल ( 58 )। संक्षेप में, सेरिबैलम के विच्छेदन क के बर्फ के ठंडा डिसोसिएशन मीडियम में कीमा कइल गइल [बिना HBSS Ca2+ आ Mg2+ के, 20 mM ग्लूकोज, पेनिसिलिन (50 U/ml) आ स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 mg/ ml) के पूरक], आ फिर पपेन [HBSS, 1-सिस्टीन·HCl के पूरक में माध्यम के पचावल गइल (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर), पपेन (16 यू / मिलीलीटर) आ डिऑक्सीराइबोन्यूक्लियस I (डीएनएज I; 0.1 मिलीग्राम/एमएल)] 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक इलाज करीं। पहिले ऊतक सभ के कमरा के तापमान पर अंडा के बलगम (10 मिलीग्राम/एमएल), बीएसए (10 मिलीग्राम/एमएल) आ डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/एमएल) वाला एचबीएसएस माध्यम में धोईं ताकि एंजाइमी पाचन ना होखे, आ फिर 20 मिमी ग्लूकोज वाला एचबीएसएस माध्यम में एचबीएसएस, पेनिसिलिन (50 यू/एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (0.05 मिलीग्राम/एमएल) आ धीरे-धीरे पीस के डीएनएज (0.1 मिलीग्राम/एमएल) एकल कोशिका के रिलीज करेला। परिणामस्वरूप कोशिका निलंबन के 70μm सेल छना के माध्यम से छानल गइल, फिर कोशिका सभ के सेंट्रीफ्यूजेशन (1110 rpm, 5 मिनट, 4°C) द्वारा गोली बनावल गइल आ छँटाई माध्यम [HBSS, 20 mM ग्लूकोज, 20% भ्रूण गोजातीय ) सीरम, पेनिसिलिन (50 U/ml) आ स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक में फिर से निलंबित कइल गइल (0.05 मिलीग्राम/एमएल)] के बा; प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ कोशिका व्यवहार्यता के मूल्यांकन करीं आ कोशिका घनत्व के 1×106 से 2×106 कोशिका/एमएल तक समायोजित करीं। फ्लो साइटोमेट्री से पहिले निलंबन के 50 माइक्रोन सेल छना के माध्यम से छानल गइल।
फ्लो साइटोमीटर के बा। सेल सॉर्टिंग 4°C पर FACSAria III मशीन (BD Biosciences) आ FACSDiva सॉफ्टवेयर (BD Biosciences, संस्करण 8.0.1) के इस्तेमाल से कइल गइल। कोशिका निलंबन के ~2800 घटना / सेकंड के दर से 20 पीएसआई के दबाव में 100 माइक्रोन नोजल के उपयोग से छाँटल गइल। चूँकि परंपरागत गेटिंग पैमाना (कोशिका आकार, बाइमोडल भेदभाव, आ बिखरल बिसेसता) अन्य कोशिका प्रकार सभ से पीएन के सही अलगाव सुनिश्चित ना क सके ला, गेटिंग रणनीति के सेट माइटोवाईएफपी + आ नियंत्रण माइटोवाईएफपी − चूहा सभ में वाईएफपी तीव्रता आ ऑटोफ्लोरोसेंस के सीधा तुलना के आधार पर कइल जाला। वाईएफपी के नमूना के 488 एनएम लेजर लाइन से बिकिरण क के उत्तेजित कइल जाला आ 530/30 एनएम बैंड पास फिल्टर के इस्तेमाल से सिग्नल के पता लगावल जाला। माइटोवाईएफपी+ चूहा सभ में, रोसा26-माइटोवाईएफपी रिपोर्टर जीन के सापेक्षिक ताकत के इस्तेमाल न्यूरॉनल बॉडी आ एक्सोन के टुकड़ा सभ के बिभेद करे खातिर भी कइल जाला। 7-AAD के 561 एनएम पीला लेजर से उत्तेजित कइल जाला आ 675/20 एनएम बैंडपास फिल्टर से पता लगावल जाला ताकि मृत कोशिका सभ के बाहर रखल जा सके। एकही समय में एस्ट्रोसाइट्स के अलग करे खातिर कोशिका निलंबन के ACSA-2-APC से रंगाई कइल गइल, फिर नमूना के 640 एनएम लेजर लाइन से बिकिरण कइल गइल आ सिग्नल के पता लगावे खातिर 660/20 एनएम बैंडपास फिल्टर के इस्तेमाल कइल गइल।
एकट्ठा कइल गइल कोशिका सभ के सेंट्रीफ्यूजेशन (1110 आरपीएम, 5 मिनट, 4°C) द्वारा गोली बनावल गइल आ इस्तेमाल तक ले -80°C पर संग्रहीत कइल गइल। Mfn2cKO चूहा आ इनहन के कूड़ा के पिल्ला सभ के एकही दिन वर्गीकरण कइल जाला ताकि प्रक्रियागत परिवर्तनशीलता कम से कम होखे। FACS डेटा प्रस्तुति आ विश्लेषण फ्लोजो सॉफ्टवेयर (फ्लोजो एलएलसी, एशलैंड, ओरेगन, अमेरिका) के उपयोग से कइल गइल।
जइसन कि ऊपर बतावल गइल बा (59), रियल-टाइम पीसीआर के इस्तेमाल बाद के mtDNA मात्रा निर्धारण खातिर सॉर्ट कइल न्यूरॉन सभ से डीएनए के अलग करे खातिर कइल जाला। रैखिकता आ थ्रेसहोल्ड संवेदनशीलता के परीक्षण सुरुआत में अलग-अलग संख्या में कोशिका सभ पर qPCR चला के कइल गइल। संक्षेप में, 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% ट्वीन 20 आ प्रोटीनेज के (200 ng/ml) से बनल लाइसिस बफर में 300 PN एकट्ठा करीं आ 55°C पर 120 मिनट ले इन्क्यूबेट करीं। कोशिका सभ के आगे 95°C पर 10 मिनट ले इन्क्यूबेट कइल गइल ताकि प्रोटीनेज के के पूरा निष्क्रिय होखल सुनिश्चित कइल जा सके।mt-Nd1 खातिर बिसेस TaqMan प्रोब (थर्मो फिशर) के इस्तेमाल से, mtDNA के नापजोख 7900HT रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में अर्ध-मात्रा पीसीआर द्वारा कइल गइल। साइंस, कैटलॉग नंबर Mm04225274_s1), mt-Nd6 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर AIVI3E8) आ 18S (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर Hs99999901_s1) जीन सभ के नाँव से जानल जाला।
प्रोटीओम के नमूना तैयार करे के बा। घोल के 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट तक गरम करके आ सोनिकेशन करके, लाइसिस बफर में [6 एम गुआनिडिन क्लोराइड, 10 एमएम ट्राइस (2-कार्बोक्जिएथिल) फॉस्फीन हाइड्रोक्लोराइड, 10 एमएम क्लोरोएसीटामाइड आ 100 एमएम ट्राइस- एचसीएल में जमल न्यूरॉन गोली लाइज]। बायोरप्टर (डायजेनोड) पर 10 मिनट (30 सेकंड के नाड़ी / 30 सेकंड के विराम अवधि) तक। नमूना के 20 mM tris-HCl (pH 8.0) में 1:10 पतला कइल गइल, 300 ng ट्रिप्सिन सोना (Promega) के साथ मिलावल गइल आ पूरा पाचन हासिल करे खातिर 37°C पर रात भर इन्क्यूबेट कइल गइल। दूसरा दिन नमूना के 20,000 ग्राम पर 20 मिनट तक सेंट्रीफ्यूज कइल गइल। सुपरनेटेंट के 0.1% फॉर्मिक एसिड से पतला कइल गइल, आ घोल के स्व-निर्मित स्टेजटिप्स से नमक से मुक्त कइल गइल। नमूना के स्पीडवैक इंस्ट्रूमेंट (एपेनडॉर्फ कंसेन्ट्रेटर प्लस 5305) में 45°C पर सुखावल गइल, आ फिर पेप्टाइड के 0.1% फॉर्मिक एसिड में निलंबित कइल गइल। सभ नमूना एक संगे एकही आदमी के ओर से तैयार कईल गईल। एस्ट्रोसाइट नमूना सभ के बिस्लेषण करे खातिर, 4 μg डिसाल्टेड पेप्टाइड सभ के टैंडम मास टैग (TMT10plex, कैटलॉग नंबर 90110, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के साथ लेबल कइल गइल जेह में पेप्टाइड आ टीएमटी रिएजेंट अनुपात 1:20 रहल। टीएमटी लेबलिंग खातिर, 0.8 मिलीग्राम टीएमटी अभिकर्मक के 70 μl निर्जल ACN में फिर से लटका दिहल गइल, आ सूखल पेप्टाइड के 9 μl 0.1 M TEAB (ट्राइएथिल अमोनियम बाइकार्बोनेट) में पुनर्गठित कइल गइल, जवना में ACN में 7 μl TMT अभिकर्मक मिलावल गइल। एकर एकाग्रता 43.75% रहे। 60 मिनट के ऊष्मायन के बाद, रिएक्शन के 2 μl 5% हाइड्रोक्सिलामाइन से बुझावल गइल। लेबल पेप्टाइड सभ के एकट्ठा कइल गइल, सुखावल गइल, 0.1% फॉर्मिक एसिड (FA) के 200μl में फिर से लटका दिहल गइल, दू में बाँटल गइल आ फिर सेल्फ-मेड स्टेजटिप्स के इस्तेमाल से नमक से मुक्त कइल गइल। अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ (अल्टीमेट 3000 अल्ट्रा हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफ) के इस्तेमाल से, दुनों आधा में से एक के 130Å1.7μm C18 कण (वाटर्स, कैटलॉग नंबर SKU: 186006935) से भरल 1mm x 150mm एक्विटी क्रोमैटोग्राफिक कॉलम पर बिभाजन कइल गइल। थर्मो फिशर साइंटिफिक के बा)। 30μl/min के प्रवाह दर पर पेप्टाइड सभ के अलग करीं, 96 मिनट के स्टेपवाइज ढाल के साथ 85 मिनट ले 1% से 50% बफर बी के अलग करीं, 50% से 95% बफर बी के 3 मिनट खातिर, फिर 95 % बफर बी खातिर 8 मिनट; बफर ए में 5% ACN आ 10 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट (ABC) होला, आ बफर B 80% ACN आ 10 mM ABC होला। हर 3 मिनट में अंश एकट्ठा क के दू गो समूह (1 + 17, 2 + 18 आदि) में मिला के वैक्यूम सेंट्रीफ्यूज में सुखा लीं।
एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण के बा। मास स्पेक्ट्रोमेट्री खातिर, पेप्टाइड (नंबर r119.aq) के 25 सेमी, 75 माइक्रोन भीतरी व्यास के पिकोफ्रिट एनालिटिकल कॉलम (नया ऑब्जेक्टिव लेंस, पार्ट नंबर PF7508250) पर अलग कइल गइल जे 1.9 माइक्रोन रेप्रोसिल-पुर 120 सी18-एक्यू मीडियम (डॉ. मैश, मैट) से लैस रहल, ईएएसवाई-एनएलसी के इस्तेमाल कइल गइल 1200 (थर्मो फिशर साइंटिफिक, जर्मनी) के बा। कॉलम के 50 डिग्री सेल्सियस पर रखल गइल। बफर ए आ बी में पानी में क्रम से 0.1% फॉर्मिक एसिड आ 80% एसीएन में 0.1% फॉर्मिक एसिड होला। पेप्टाइड सभ के 65 मिनट ले 6% से 31% बफर बी ले, आ 5 मिनट ले 31% से 50% बफर बी ले 200 nl/min के स्टेपवाइज ढाल के साथ अलग कइल गइल। इल्यूट भइल पेप्टाइड सभ के बिस्लेषण ऑर्बिट्रैप फ्यूजन मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर कइल गइल। पेप्टाइड प्रीकरसर m/z माप 350 से 1500 m/z के रेंज में 120,000 के रिजोल्यूशन के साथ कइल जाला। 27% नॉर्मलाइज्ड टक्कर ऊर्जा के इस्तेमाल से, 2 से 6 के चार्ज स्टेट वाला सभसे मजबूत अग्रदूत के उच्च ऊर्जा सी ट्रैप डिसोसिएशन (HCD) क्लीवेज खातिर चुनल जाला। चक्र के समय 1 s पर सेट कइल गइल बा। पेप्टाइड टुकड़ा के m/z मान के माप आयन ट्रैप में 5×104 के सबसे छोट एजीसी टारगेट आ अधिकतम इंजेक्शन समय 86 एमएस के इस्तेमाल से कइल गइल। विखंडन के बाद, पूर्ववर्ती के 45 s तक गतिशील बहिष्कार सूची में रखल गईल। टीएमटी-लेबल पेप्टाइड सभ के 50 सेमी, 75 माइक्रोन के एक्लेम पेपमैप कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, कैटलॉग नंबर 164942) पर अलग कइल गइल आ माइग्रेशन स्पेक्ट्रा सभ के बिस्लेषण ऑर्बिट्रैप लुमोस ट्राइब्रिड मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) पर कइल गइल जे हाई-फील्ड असममित वेवफॉर्म आयन (FAIMS) उपकरण से लैस रहल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) −50 आ −70 V के दू गो कम्पेंसेशन वोल्टेज पर काम करे ला।सिंक्रनाइजेशन प्रीकरसर के आधार पर चुनल गइल MS3 के इस्तेमाल टीएमटी रिपोर्ट आयन सिग्नल माप खातिर कइल जाला। पेप्टाइड अलगाव EASY-nLC 1200 पर कइल गइल, 90% रैखिक ढाल इल्यूशन के इस्तेमाल से, बफर एकाग्रता 6% से 31% के साथ; बफर ए 0.1% एफए रहे, आ बफर बी 0.1% एफए आ 80% एसीएन रहे। विश्लेषणात्मक कॉलम के 50 डिग्री सेल्सियस पर संचालित कइल जाला। मूल फाइल के FAIMS मुआवजा वोल्टेज के अनुसार विभाजित करे खातिर फ्रीस्टाइल (संस्करण 1.6, थर्मो फिशर साइंटिफिक) के इस्तेमाल करीं।
प्रोटीन के पहचान आ मात्रा निर्धारण। एकीकृत एंड्रोमेडा सर्च इंजन के इस्तेमाल से मूल डेटा के विश्लेषण मैक्सक्वांट संस्करण 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) के इस्तेमाल से कइल गइल। एक्वेरिया विक्टोरिया से मिलल Cre रिकॉम्बिनेज आ YFP अनुक्रम सभ के अलावा, पेप्टाइड टुकड़ा स्पेक्ट्रा सभ में माउस संदर्भ प्रोटीओम (Proteome ID UP000000589, मई 2017 में UniProt से डाउनलोड कइल गइल) के कैनोनिकल अनुक्रम आ आइसोफॉर्म अनुक्रम के खोज कइल गइल। मेथियोनिन ऑक्सीकरण आ प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटाइलेशन के चर संशोधन के रूप में सेट कइल गइल; सिस्टीन कार्बामोइल मिथाइलेशन के निश्चित संशोधन के रूप में सेट कइल गइल। पाचन पैरामीटर के “विशिष्टता” आ “ट्रिप्सिन/पी” पर सेट कइल जाला। प्रोटीन के पहिचान खातिर इस्तेमाल होखे वाला पेप्टाइड आ रेजर पेप्टाइड सभ के न्यूनतम संख्या 1 होला; अनोखा पेप्टाइड के न्यूनतम संख्या 0. पेप्टाइड मैप मिलान के स्थिति में प्रोटीन के पहचान दर 0.01 रहे। “दूसरा पेप्टाइड” विकल्प सक्षम बा। अलग-अलग मूल फाइल के बीच सफल पहचान के स्थानांतरित करे खातिर “match between runs” विकल्प के इस्तेमाल करीं। लेबल-मुक्त मात्रा निर्धारण (LFQ) (60) खातिर LFQ न्यूनतम अनुपात गिनती 1 के उपयोग करीं। LFQ तीव्रता के हर समय बिंदु पर कम से कम एक ठो जीनोटाइप समूह में कम से कम दू गो मान्य मान सभ खातिर छानल जाला, आ चौड़ाई के सामान्य बितरण से एक्सट्रैपोलेट कइल जाला। 0.3 आ नीचे 1.8 के ओर बढ़े के बा। एलएफक्यू के परिणाम के विश्लेषण करे खातिर पर्सियस कंप्यूटिंग प्लेटफॉर्म (https://maxquant.net/perseus/) आ आर (https://r-project.org/) के इस्तेमाल करीं। डिफरेंसियल एक्सप्रेशन एनालिसिस ( 61 ) खातिर लिमा सॉफ्टवेयर पैकेज से एगो दू-तरफा मध्यम टी परीक्षण के इस्तेमाल कइल गइल। अन्वेषणात्मक डेटा विश्लेषण ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally आ pheatmap के इस्तेमाल से कइल जाला। टीएमटी आधारित प्रोटीओमिक्स डेटा के विश्लेषण मैक्सक्वांट संस्करण 1.6.10.43 के इस्तेमाल से कइल गइल। यूनिप्रोट के ह्यूमन प्रोटीओमिक्स डेटाबेस से कच्चा प्रोटीओमिक्स डेटा के खोज करीं, जवन सितंबर 2018 में डाउनलोड भइल रहे।एह विश्लेषण में निर्माता द्वारा उपलब्ध करावल गइल आइसोटोप प्यूरिटी करेक्शन फैक्टर शामिल बा। विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण खातिर आर में लिम्मा के प्रयोग करीं। मूल डेटा, डेटाबेस खोज परिणाम, आ डेटा बिस्लेषण वर्कफ़्लो आ परिणाम सभ के डेटा सेट आइडेंटिफायर PXD019690 के साथ PRIDE पार्टनर रिपोजिटरी के माध्यम से प्रोटीओमएक्सचेंज गठबंधन में संग्रहीत कइल जाला।
कार्यात्मक एनोटेशन विश्लेषण के समृद्ध करेला। 8 सप्ताह में सेट कइल गइल डेटा के कार्यात्मक एनोटेशन पद के समृद्धि के निर्धारण करे खातिर चातुर्य पथ विश्लेषण (QIAGEN) टूल के इस्तेमाल कइल गइल (चित्र 1)। संछेप में, एलसी-एमएस/एमएस (टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री) डेटा बिस्लेषण से मिलल मात्रात्मक प्रोटीन लिस्ट के इस्तेमाल निम्नलिखित फिल्टर पैमाना के साथ कइल जाला: मस मस्कुलस के प्रजाति आ पृष्ठभूमि के रूप में चुनल जाला आ श्रेणी में बेंजामिन द्वारा 0.05 या एकरे से कम समृद्धि खातिर समायोजित पी मान देखावल गइल बा। एह ग्राफ खातिर समायोजित पी मान के आधार पर हर क्लस्टर में शीर्ष पांच अतिरिक्त श्रेणी देखावल गइल बा। मल्टीपल टी-टेस्ट के इस्तेमाल से, बेंजामिन, क्रिएगर, आ येकुतिएली (Q = 5%) के दू-चरण के रैखिक बूस्ट प्रोग्राम के इस्तेमाल से, हर श्रेणी में चिन्हित महत्वपूर्ण उम्मीदवार सभ पर टाइम-कोर्स प्रोटीन एक्सप्रेशन बिस्लेषण कइल जाला आ हर पंक्ति के अलग-अलग बिस्लेषण कइल जाला। लगातार एसडी अपनावे के जरूरत नइखे.
प्रकाशित डेटाबेस के साथ एह अध्ययन के परिणाम के तुलना करे आ चित्र 1 में वेन आरेख पैदा करे खातिर, हमनी के मात्रात्मक प्रोटीन सूची के माइटोकार्टा 2.0 एनोटेशन ( 24 ) के साथ जोड़नी जा। आरेख बनावे खातिर ऑनलाइन टूल Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) के इस्तेमाल करीं।
प्रोटीओमिक्स विश्लेषण खातिर इस्तेमाल होखे वाला सांख्यिकीय प्रक्रिया सभ के बिस्तार से जानकारी खातिर, कृपया सामग्री आ तरीका के संबंधित खंड के देखल जाय। बाकी सभ प्रयोग सभ खातिर, बिस्तार से जानकारी संबंधित किंवदंती में मिल सके ला। जबले कि अन्य तरीका से ना बतावल गइल होखे, सभ डेटा के औसत ± SEM के रूप में बतावल जाला, आ सभ सांख्यिकीय बिस्लेषण ग्राफपैड प्रिज्म 8.1.2 सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल से कइल गइल।
एह लेख खातिर पूरक सामग्री खातिर, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 देखल जाय
ई एगो खुला पहुँच वाला लेख हवे जे क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-व्यावसायिक लाइसेंस के शर्त के तहत बितरित कइल गइल बाटे, जवना में कौनों भी माध्यम में इस्तेमाल, बितरण आ रिप्रोडक्शन के इजाजत बाटे, जबले कि अंतिम इस्तेमाल ब्यापारिक फायदा खातिर ना होखे आ आधार ई होखे कि मूल रचना सही होखे। सिफारिश।
नोट: हमनी के रउआँ से खाली आपन ईमेल पता देवे के कहत बानी जा ताकि जवना आदमी के रउआँ पन्ना पर सिफारिश कइले बानी ऊ जान जाव कि रउआँ चाहत बानी कि ऊ ईमेल देखे आ ई स्पैम ना ह। हमनी के कवनो ईमेल पता के कैप्चर ना करब जा।
एह सवाल के इस्तेमाल एह बात के परीक्षण करे खातिर कइल जाला कि रउरा विजिटर हईं कि ना आ स्वचालित स्पैम सबमिशन रोके खातिर.
ई. मोटोरी, आई. अतानासोव, एसएमवी कोचन, के फोल्ज-डोनाहुए, वी. सक्तिवेलू, पी. जियावालिस्को, एन.टोनी, जे.पुयाल, एन.-जी. लार्सन के नाम से जानल जाला
बेकाम न्यूरॉन के प्रोटीओमिक्स विश्लेषण से पता चलल कि न्यूरोडिजनरेशन के मुकाबला करे खातिर मेटाबोलिक प्रोग्राम सक्रिय होला।
ई. मोटोरी, आई. अतानासोव, एसएमवी कोचन, के फोल्ज-डोनाहुए, वी. सक्तिवेलू, पी. जियावालिस्को, एन.टोनी, जे.पुयाल, एन.-जी. लार्सन के नाम से जानल जाला
बेकाम न्यूरॉन के प्रोटीओमिक्स विश्लेषण से पता चलल कि न्यूरोडिजनरेशन के मुकाबला करे खातिर मेटाबोलिक प्रोग्राम सक्रिय होला।
©2020 अमेरिकन एसोसिएशन फॉर द एडवांसमेंट ऑफ साइंस के ह। सब अधिकार सुरक्षित बा। एएएएस हिनारी, अगोरा, ओएरे, कोरस, क्लॉकएसएस, क्रॉसरेफ आ काउंटर के पार्टनर हवे। साइंसएडवांस आईएसएसएन 2375-2548 पर बा।