कोशिका के डिब्बाबंदी आ होमियोस्टेसिस के बनावे रखे खातिर स्राव मार्ग में प्रोटीन के छँटाई बहुत जरूरी बा। खोल-मध्यस्थता वाला छँटाई के अलावा, स्राव परिवहन के प्रक्रिया में किनेसिन छँटाई में लिपिड सभ के भूमिका एगो लंबा समय से चलल आ रहल मूलभूत सवाल बाटे जेकर जवाब अबहिन ले नइखे मिलल। इहाँ, हमनी के 3D एक साथ बहुरंगी हाई-रिजोल्यूशन रियल-टाइम इमेजिंग करेनी जा ताकि इन विवो में साबित हो सके कि बहुत लंबा सेरामाइड लिपिड हिस्सा वाला नया संश्लेषित ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल-इमोबिलाइज्ड प्रोटीन सभ के समूहबद्ध कइल जाला आ बिसेस एंडोप्लाज्म में वर्गीकृत कइल जाला नेट निकास साइट, जवन ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन सभ द्वारा इस्तेमाल होखे वाला प्रोटीन सभ से अलग होला। एकरे अलावा, हमनी के ई देखावे के बा कि एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम झिल्ली में सेरामाइड के चेन लंबाई एह छँटाई चयनात्मकता खातिर बहुत महत्व के बा। हमनी के अध्ययन लिपिड श्रृंखला के लंबाई के आधार प प्रोटीन कार्गो के स्राव मार्ग में चयनात्मक निर्यात साइट में वर्गीकृत करे खाती पहिला सीधा इन विवो सबूत उपलब्ध करावेला।
यूकेरियोटिक कोशिका सभ में, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ER) में संश्लेषित प्रोटीन सभ के एकरे बाद स्राव मार्ग के माध्यम से परिवहन के दौरान छाँटल जाला ताकि उनके उचित कोशिका गंतव्य (1) पर पहुँचावल जा सके। कोट-मध्यस्थता वाला छँटाई के अलावा, लंबा समय से ई अनुमान लगावल गइल कि कुछ लिपिड सभ बिसेस प्रोटीन सभ के बिसेस झिल्ली डोमेन सभ में समूहबद्ध क के चयनात्मक निकास बिंदु के रूप में भी काम क सके लें (2-5)। हालाँकि, अबहिन ले एह संभावित लिपिड आधारित तंत्र के साबित करे खातिर सीधा इन विवो सबूत के कमी बा। एह बुनियादी समस्या के हल करे खातिर हमनी के खमीर में अध्ययन कइनी जा कि कइसे ग्लाइकोसाइलफॉस्फेटिडिलिनोसिटोल (जीपीआई) एंकर प्रोटीन (जीपीआई-एपी) के ईआर से अंतर से निर्यात कइल जाला। जीपीआई-एपी लिपिड से जुड़ल कोशिका सतह प्रोटीन के कई तरह के हवें ( 6, 7 )। जीपीआई-एपी एगो स्रावित प्रोटीन हवे जे ग्लाइकोलिपिड हिस्सा (जीपीआई एंकर) के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक सभ से जुड़ल होला। ई लोग जीपीआई एंकर के ईआर लुमेन में रूढ़िवादी पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन के रूप में स्वीकार करेला (8)। लगाव के बाद जीपीआई-एपी ईआर से गोल्गी यंत्र (5, 9) से हो के प्लाज्मा झिल्ली में जाला। जीपीआई एंकर सभ के मौजूदगी के कारण जीपीआई-एपी के स्राव मार्ग के साथ ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन (अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन सभ सहित) से अलगा से ले जाइल जाला (5, 9, 10)। खमीर कोशिका सभ में, जीपीआई-एपी सभ के एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में अन्य स्रावित प्रोटीन सभ से अलग कइल जाला, आ फिर कोट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स II (COPII) (6, 7) द्वारा लपेटल बिसेस पुटिका सभ में पैक कइल जाला। ईआर निर्यात प्रक्रिया में एह वर्गीकरण प्रक्रिया के निर्धारक अस्पष्ट बाड़ें, बाकी अनुमान लगावल जाला कि एह तंत्र खातिर लिपिड सभ के जरूरत पड़ सके ला, खासतौर पर जीपीआई एंकर के लिपिड हिस्सा के संरचनात्मक रिमोडलिंग (5, 8)। खमीर में जीपीआई के जुड़ाव के तुरंत बाद जीपीआई लिपिड रिमोडलिंग शुरू हो जाला आ कई मामिला में, एकरे कारण सेरामाइड 26-कार्बन लंबा श्रृंखला वाला संतृप्त फैटी एसिड (C26:0) से जुड़ जाला (11, 12)। C26 सेरामाइड अबतक ले खमीर कोशिका सभ द्वारा पैदा कइल गइल मुख्य सेरामाइड हवे। एकर संश्लेषण ईआर में होला आ एकर अधिकतर हिस्सा सीओपीआईआई पुटिका (13) के माध्यम से गोल्गी यंत्र में निर्यात होला। जीपीआई-एपी के ईआर निर्यात खातिर बिसेस रूप से जारी सेरामाइड संश्लेषण (14, 15) के जरूरत होला, आ बदले में, गोल्गी यंत्र में सेरामाइड के इनोसिटोल फॉस्फेट सेरामाइड (आईपीसी) में बदलल जीपीआई एंकर संश्लेषण (16) पर निर्भर करे ला। कृत्रिम झिल्ली सभ के साथ जैव भौतिक अध्ययन से पता चलल बा कि बहुत लंबा एसिल चेन वाला सेरामाइड सभ एकट्ठा हो के बिसेस भौतिक गुण वाला क्रमबद्ध डोमेन बना सके लें ( 17 , 18 )। एह डेटा सभ से ई परिकल्पना पैदा हो जाले कि C26 सेरामाइड आ C26 सेरामाइड के साथ GPI-AP अपना भौतिक गुण सभ के इस्तेमाल अपेक्षाकृत गन्दा ईआर झिल्ली लिपिड वातावरण में व्यवस्थित इलाका भा इलाका सभ में एकट्ठा होखे खातिर करे लें। ई मुख्य रूप से छोट आ असंतृप्त ग्लिसरॉलिपिड (C16:1 आ C18:1) से बनल होला (19, 20)। ई क्षेत्र चुनिंदा रूप से विशिष्ट ईआर निकास साइट (ERES) पर केंद्रित होखीहें, जहाँ सेरामाइड आ सेरामाइड आधारित जीपीआई-एपी के एकही समर्पित COPII पुटिका में गोल्गी में सह-परिवहन कइल जा सकेला (5)।
एह अध्ययन में, हमनी के सीधे सुपर-रिजोल्यूशन कॉनफोकल रियल-टाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (SCLIM) के इस्तेमाल से एह लिपिड आधारित तंत्र के परीक्षण कइले बानी जा, जवन एगो अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक हवे जे एक साथ फ्लोरोसेंट लेबल प्रोटीन सभ के देख सके ला तीन रंग आ तीन आयामी (3D) छवि सभ के जिंदा कोशिका सभ में बेहद ढेर रिजोल्यूशन आ गति होला (21, 22)।
हमनी के सबसे पहिले एससीएलआईएम तकनीक के लागू कईनी जा ताकि आगे परिभाषित कईल जा सके कि कइसे एस सेरेविसिया में ईआर छोड़ला के बाद ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन से सी 26 सेरामाइड समूह के संगे सामान्य जीपीआई-एपी के जांच कईल गईल। ईआर के वर्गीकरण के जांच करे के क्रम में, हमनी के एगो आनुवंशिक प्रणाली के इस्तेमाल कईनी जा जवन सीधे विवो में ईआरईएस में प्रवेश करे वाला नव संश्लेषित माल के कल्पना क सकता ( 7 , 23 )। कार्गो के रूप में, हमनी के ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ लेबल C26 सेरामाइड आधारित GPI-AP Gas1 आ नियर-इन्फ्रारेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (iRFP) के साथ लेबल ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2 चुननी जा, जवन दुनो प्लाज्मा झिल्ली (24-26) के निशाना बनावेला। sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित में ई दुनों कार्गो गैलेक्टोज-इंड्यूसिबल प्रोमोटर आ कंस्टिट्यूटिव ईआरईएस मार्कर के तहत एक्सप्रेस होखे लें। चरम तापमान (37°C) पर, काहें से कि sec31-1 उत्परिवर्तन COPII के अंकुरण आ ईआर निर्यात के रोके खातिर COPII कोट घटक Sec31 के कामकाज के प्रभावित करे ला, ईआर (23) पर नया संश्लेषित माल जमा हो जाला। कम तापमान (24°C) पर ठंडा भइला के बाद sec31-1 उत्परिवर्तित कोशिका सभ स्राव क्षेत्र से ठीक हो गइलीं आ जमा भइल नया सिंथेटिक कार्गो के ईआर से निर्यात होखे लागल। CLIM विजुअलाइजेशन से पता चलल कि नया संश्लेषित Gas1-GFP आ Mid2-iRFP के अधिकतर हिस्सा 37°C पर ऊष्मायन के बाद भी sec31-1 उत्परिवर्तित कोशिका सभ के ईआर में जमा हो जाला आ फिर 24°C पर 5 मिनट ले रिलीज हो जाला (चित्र 1)। चूँकि Mid2-iRFP पूरा ईआर झिल्ली पर बितरित होला, आ Gas1-GFP असंतत ईआर झिल्ली क्षेत्र में गाढ़ आ एकट्ठा होला, एह से इनहन के बितरण बिल्कुल अलग होला (चित्र 1, ए से सी आ मूवी S1)। एकरे अलावा, जइसे कि चित्र 1D में देखावल गइल बा, Gas1-GFP क्लस्टर में Mid2-iRFP ना होला। ई परिणाम बतावे लें कि जीपीआई-एपी आ ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन सभ के अलग-अलग ईआर झिल्ली क्षेत्र सभ में जल्दी अलग कइल गइल। Gas1-GFP समूह mCherry के COPII कोट प्रोटीन Sec13 (चित्र 1, ई आ एफ, आ मूवी S1) (23) के साथ लेबल कइल गइल एगो बिसेस ERES से सटल बा।
sec31-1 कोशिका सभ गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव के एक्सप्रेस करे लीं, एगो लंबा एसिली चेन (C26) सेरामाइड GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ग्रीन) आ ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन Mid2-iRFP (TMP, नीला) के एक्सप्रेस करे लीं आ ई कंस्ट्रक्टिव ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) के 37°C पर 30 मिनट ले इन्क्यूबेट कइल गइल, ले जाइल गइल 24°C, आ 5 मिनट बाद SCLIM द्वारा इमेजिंग कइल गइल। (A से C) में कौनों प्लेन (A) के प्रतिनिधि मर्ज भा सिंगल 2D इमेज, 10 z-सेक्शन (B) के 2D प्रोजेक्शन इमेज भा कार्गो आ ERES मार्कर (C) के 3D सेल गोलार्ध छवि देखावल गइल बा। स्केल बार 1μm (ए अउर बी)। पैमाना इकाई 0.551μm (C) बा। Gas1-GFP के पता असतत ईआर क्षेत्र भा समूह में लगावल गइल, जबकि Mid2-iRFP के पता लगावल गइल आ पूरा ईआर झिल्ली (सी) में वितरित कइल गइल। (D) ग्राफ में सफेद तीर रेखा (बाएं) के साथ Gas1-GFP समूह में Gas1-GFP आ Mid2-iRFP के सापेक्षिक प्रतिदीप्ति तीव्रता देखावल गइल बा। एयू, मनमाना इकाई के बा। (E आ F) 3D इमेज के प्रतिनिधित्व करे ला जे माल आ ERES निशान के संयोजन करे ला। विशिष्ट ईआरईएस के पास गैस1-जीएफपी समूह के पता लगावल गइल। पैमाना इकाई 0.551μm बा। (F) सफेद ठोस तीर ERES से जुड़ल Gas1-GFP समूह के चिन्हित करेला। बीच आ दाहिना पैनल में मर्ज कइल गइल बढ़ल 3D इमेज आ चुनल गइल Gas1-GFP क्लस्टर के घुमावल दृश्य देखावल गइल बा।
Gas1-GFP क्लस्टर आ एगो बिसेस ERES के बीच के करीबी स्थानिक संबंध बतावे ला कि Gas1-GFP चयनात्मक ERES में प्रवेश क सके ला, जवन ईआर से बाहर निकले खातिर Mid2-iRFP द्वारा इस्तेमाल कइल जाए वाली चयनात्मकता से अलग होला। एह संभावना के संबोधित करे खातिर हमनी के खाली एक या दू गो सामान खातिर ईआरईएस अनुपात के मात्रा निर्धारित कइनी जा (चित्र 2, ए से सी)। हमनी के पाता चलल कि अधिकांश ईआरईएस (70%) में सिर्फ एक प्रकार के माल होखेला। चित्र 2C के नीचे के छवि में ERES के दू गो बिसेस उदाहरण देखावल गइल बा जेह में खाली Gas1-GFP (चित्र 1) या खाली Mid2-iRFP (चित्र 2) बा। एकरे बिपरीत, लगभग 20% ईआरईएस में दू गो माल होला जे एकही इलाका में ओवरलैप होलें। पावल गइल कि कुछ ईआरएस (10%) में दू तरह के माल रहे, लेकिन ई साफ-साफ अलग-अलग इलाका में अलग-थलग रहे। एह से ई सांख्यिकीय बिस्लेषण बतावे ला कि ईआर के निर्यात के बाद जीपीआई-एपी गैस1-जीएफपी आ ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो मिड2-आईआरएफपी के अलग-अलग ईआरईएस में बाँटल जाला (चित्र 2डी)। ई छँटाई के दक्षता पिछला जैव रासायनिक विश्लेषण (6) आ रूपात्मक निर्धारण (7) के साथ बहुत मेल खाला। हमनी के ईआरईएस में प्रवेश करे वाला क्वारंटाइन में राखल माल के व्यवहार के भी देख सकेनी जा (चित्र 2E आ मूवी S2)। चित्र 2E से पता चले ला कि Gas1-GFP (पैनल 3) या Mid2-iRFP (पैनल 4) के खाली एगो छोट हिस्सा एक ओर से ERES में प्रवेश करे ला आ अलग-अलग इलाका में सीमित होला। चित्र 2E के पैनल 5 से पता चले ला कि Gas1-GFP आ Mid2-iRFP कबो-कबो एकही ERES में पावल जालें, बाकी ई अलग-अलग ओर से प्रवेश करे लें आ अलग-अलग इलाका सभ में केंद्रित होलें जे अलग-अलग COPII पुटिका सभ के प्रतिनिधित्व क सके लें। हमनी के इहो पुष्टि कइनी जा कि चयनात्मक ERES के रूप में C26 सेरामाइड आधारित GPI-AP Gas1 के देखल गइल अलगाव आ वर्गीकरण विशिष्ट बा काहें से कि एगो अउरी ट्रांसमेम्ब्रेन स्राव कार्गो, GFP-टैग कइल प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन Axl2 (27 ), Mid2-iRFP के समान व्यवहार देखावे ला। (चित्र एस 1 आ मूवी एस 3) के बा। नया संश्लेषित Axl2-GFP Mid2-iRFP नियर ईआर झिल्ली के माध्यम से बितरित होला (चित्र S1, A आ B), आ अधिकतर ERES में Mid2-iRFP के साथ सह-स्थानीय होला (चित्र S1, B से D)। चित्र 1 के पैनल 1 आ 2.S1C में ERES के दू गो ठेठ उदाहरण देखावल गइल बा जहाँ दू गो ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो ओवरलैप होला। एह मामिला में दुनों सामान एक साथ ईआरईएस में प्रवेश करे ला (चित्र S1E, पैनल 3 आ मूवी S3)।
गैलेक्टोज इंड्यूसिबल स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, ग्रीन) आ Mid2-iRFP (TMP, नीला) आ कंस्टिट्यूटिव ERES लेबलिंग Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) के एक्सप्रेस करे वाली sec31-1 कोशिका सभ के °C पर 30 मिनट ले इनक्यूबेट कइला के बाद 37 पर रखल गइल, स्राव ब्लॉक के रिलीज करे खातिर 24 °C पर ले जाइल गइल, आ एकरे बाद SCLIM के साथ इमेज कइल गइल 20 मिनट के बा। (ए से सी) कार्गो के प्रतिनिधि 2 डी प्रोजेक्शन इमेज (ए; स्केल बार, 1μm) या 3D सेल गोलार्ध छवि (बी आ सी; स्केल यूनिट, 0.456μm) आ ईआरईएस द्वारा चिन्हित 10 जेड-सेक्शन। (B) में निचला पैनल आ (C) में पैनल प्रोसेस कइल छवि सभ के डिस्प्ले करे ला ताकि खाली ERES (मैजेंटा) [Gas1-GFP (ग्रे) आ Mid2-iRFP (हल्का नीला)] में मौजूद सामान सभ के देखावल जा सके। (C) खुला तीर: ईआरईएस खाली एगो माल के टुकड़ा (1 से 4) ले जाला। ग्रे तीर: ईरेस में अलग-थलग माल (5) होला। सफेद ठोस तीर: सह-स्थापित माल युक्त ईआरईएस। नीचे: चुनल गइल एकल ERES में खाली Gas1-GFP (1) या Mid2-iRFP (2) होला। स्केल बार, 100 एनएम के बा। (D) (C) में वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ के मात्रा निर्धारण। ईआरईएस के औसत प्रतिशत जवना में खाली एगो कार्गो (Gas1-GFP या Mid2-iRFP), अलग-अलग कार्गो आ ओवरलैपिंग कार्गो होला। तीन स्वतंत्र प्रयोग में, 54 कोशिका में n = 432। त्रुटि बार = एसडी के बा। दू पूंछ वाला बिना जोड़ी वाला टी परीक्षण। *** पी = 0.0002 के बा। (ई) क्वारंटाइन कार्गो के चयनित ईआरईएस के 3 डी छवि (सी) से चिह्नित। Gas1-GFP (हरा) (3) या Mid2-iRFP (नीला) (4) एक ओर से ERES (मैजेंटा) में प्रवेश करे ला आ ERES के भीतर एगो छोट इलाका में सीमित होला। कई बेर, दुनों प्रकार के माल एकही ओर से एकही ईआरईएस (5) में प्रवेश करे ला आ ईआरईएस के भीतर कौनों अलग-थलग इलाका में सीमित हो जाला। स्केल बार, 100 एनएम के बा।
एकरा बाद हमनी के एगो परिकल्पना के परीक्षण कईनी जा कि ईआर झिल्ली में मौजूद लंबा एसिल चेन सेरामाइड (C26) Gas1 के विशिष्ट क्लस्टरिंग अवुरी छंटाई के चयनात्मक ERES में चलावेला। एकरा खातिर, हमनी के एगो संशोधित खमीर तनाव GhLag1 के इस्तेमाल कईनी जा, जवना में दुनो अंतर्जात सेरामाइड सिंथेज Lag1 अवुरी Lac1 के GhLag1 (कपास के Lag1 होमोलॉग) से बदल दिहल गईल, जवना के नतीजा में जंगली प्रकार से छोट कोशिका झिल्ली सेरामाइड तनाव वाला खमीर तनाव पैदा भईल (चित्र 3 ए) (28)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) के बिस्लेषण से पता चलल कि जंगली किसिम के उपजाति सभ में कुल सेरामाइड के 95% बहुत लंबा (C26) चेन सेरामाइड होला जबकि GhLag1 में 85% सेरामाइड बहुत लंबा (C18 आ C16) होला। ), सेरामाइड के मात्र 2% बहुत लंबा (C26) श्रृंखला के सेरामाइड होला। हालाँकि, अबतक ले GhLag1 झिल्ली में पता चलल मुख्य सेरामाइड सभ में C18 आ C16 सेरामाइड बाड़ें, एमएस बिस्लेषण से ई भी पुष्टि भइल कि GhLag1 तनाव में एक्सप्रेस कइल गइल Gas1-GFP के GPI एंकर में C26 सेरामाइड होला जे जंगली किसिम के लिपिड सभ के तुलना में होला। गुणवत्ता एके जइसन बा (चित्र 3 ए) (26)। एह से एकर मतलब ई बा कि सेरामाइड रिमोडलिंग एंजाइम Cwh43 C26 सेरामाइड खातिर बहुत चयनात्मक होला, जइसे कि चित्र 26 में देखावल गइल बा, ई GhLag1 तनाव में C26 सेरामाइड के थोड़ मात्रा से GPI एंकर के प्राथमिकता से सामिल करे ला। एस 2 (29) के बा। एकरा बावजूद, GhLag1 के कोशिका झिल्ली में मूल रूप से खाली C18-C16 सेरामाइड होला जबकि Gas1-GFP में अबहिन ले C26 सेरामाइड होला। ई तथ्य एह तनाव के ईआर में झिल्ली सेरामाइड के एसिल चेन लंबाई के समस्या के बिसेस रूप से हल करे खातिर एगो आदर्श उपकरण बनावे ला। वर्ग आ छँटाई के काल्पनिक भूमिका। फिर, हमनी के सबसे पहिले पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से sec31-1 के तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित एलील के साथ GhLag1 में समूह में जमा होखे के C26 Gas1-GFP के क्षमता के अध्ययन कइनी जा, जहाँ ईआर झिल्ली सेरामाइड (चित्र 3) में खाली लंबा (C18-C16) श्रृंखला मौजूद बा। हमनी के देखनी जा कि sec31-1 में, Gas1-GFP के अधिकांश समूह में केंद्रित रहे, जबकि लंबा (C18-C16) लंबा सेरामाइड ईआर झिल्ली वाला sec31-1 GhLag1 में Gas1-GFP मुख्य रूप से समूह में ना रहे अवुरी पूरा ईआर झिल्ली में वितरित ना रहे। सटीक कहल जाव त, काहें से कि C26 सेरामाइड आधारित क्लस्टरिंग विशिष्ट ERES (चित्र 1) से निकटता से संबंधित बा, हमनी के अगिला जांच कइनी जा कि का एह प्रक्रिया में ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्र के कामकाज भी शामिल हो सकेला। जीपीआई-एपी ईआर निर्यात खातिर एगो बिसेस सीओपीआईआई सिस्टम के इस्तेमाल करे ला, जे सक्रिय रूप से जीपीआई एंकर (30, 31) के ग्लाइकन हिस्सा के Ted1 के संरचनात्मक रिमोडलिंग द्वारा नियंत्रित होला। एकरे बाद रिकॉम्बिनेंट जीपीआई-ग्लाइकन के ट्रांसमेम्ब्रेन कार्गो रिसेप्टर p24 कॉम्प्लेक्स द्वारा पहिचानल जाला, जे बदले में चुनिंदा रूप से Lst1 के भर्ती करे ला, जवन प्रमुख COPII कार्गो बाइंडिंग सबयूनिट Sec24 के एगो बिसेस आइसोफॉर्म हवे, जेकरा से जीपीआई-एपी-समृद्ध COPII पुटिका सभ के जरूरत होला (31-33)। एहसे, हमनी के एगो डबल म्यूटेंट के निर्माण कईनी जा जवन कि sec31-1 उत्परिवर्तित तनाव के संगे ए एकल प्रोटीन (p24 जटिल घटक Emp24, GPI-ग्लाइकन रिमोडलिंग एंजाइम Ted1 अवुरी विशिष्ट COPII सबयूनिट Lst1) के डिलीशन के संयोजन कईले, अवुरी एकर अध्ययन कईनी कि का Gas1-क्लस्टर GFP बनावल संभव बा (चित्र 3)। हमनी के देखनी जा कि sec31-1emp24Δ आ sec31-1ted1Δ में, Gas1-GFP मुख्य रूप से अनक्लस्टर आ पूरा ईआर झिल्ली में वितरित होला, जइसे कि पहिले sec31-1 GhLag1 में देखल गइल रहे, जबकि sec31-1lst1Δ में, Gas1-GFP Like sec31-1। ई परिणाम बतावे लें कि ईआर झिल्ली में C26 सेरामाइड के मौजूदगी के अलावा, Gas1-GFP के क्लस्टरिंग के भी p24 कॉम्प्लेक्स से जुड़ल जरूरी होला, आ बिसेस Lst1 भर्ती के जरूरत ना पड़े ला। एकरा बाद, हमनी के संभावना के खोज कईनी कि ईआर झिल्ली में सेरामाइड के श्रृंखला के लंबाई Gas1-GFP के p24 से बाइंडिंग के नियंत्रित क सकता। हालांकि, हमनी के पाता चलल कि झिल्ली में C18-C16 सेरामाइड के मौजूदगी p24 परिसर (चित्र S3 अवुरी S4, A अवुरी B) द्वारा पुनर्निर्माण भईल जीपीआई-ग्लाइकन के प्रभावित ना करेला चाहे जीपीआई-एपी से जुड़ल अवुरी जीपीआई-एपी के निर्यात करेला। जोग्यता। COPII उपप्रकार Lst1 (चित्र S4C) के भर्ती करीं। एह से, C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग में अलग-अलग ईआर निर्यात प्रोटीन तंत्र सभ के साथ प्रोटीन के परस्पर क्रिया के जरूरत ना पड़े ला, बलुक लिपिड लंबाई से संचालित वैकल्पिक छँटाई तंत्र के समर्थन करे ला। फिर, हमनी के विश्लेषण कईनी कि का ईआर झिल्ली में सेरामाइड एसिल श्रृंखला के लंबाई चयनात्मक ईआरईएस के रूप में Gas1-GFP के प्रभावी वर्गीकरण खातिर महत्वपूर्ण बा। चूँकि छोट श्रृंखला वाला सेरामाइड वाला GhLag1 तनाव में Gas1 ईआर से बाहर निकल के प्लाज्मा झिल्ली में प्रवेश करेला (चित्र S5), हमनी के मानना ​​बा कि अगर छँटाई सेरामाइड एसिल चेन के लंबाई से चलावल जाव त GhLag1 तनाव में Gas1 के रिडायरेक्ट आ पार कइल जा सकेला। एकही झिल्ली वाला ईआरईएस माल।
(A) GhLag1 के कोशिका झिल्ली में मुख्य रूप से छोट C18-C16 सेरामाइड होखेला, जबकि Gas1-GFP के जीपीआई एंकर में अभी भी जंगली प्रकार के कोशिका के समान C26 आईपीसी बा। ऊपर: मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा जंगली प्रकार (Wt) आ GhLag1p उपभेदन के कोशिका झिल्ली में सेरामाइड के एसिली चेन लंबाई के विश्लेषण। डेटा कुल सेरामाइड के प्रतिशत के प्रतिनिधित्व करेला। तीन स्वतंत्र प्रयोग के औसत। त्रुटि बार = एसडी के बा। दू पूंछ वाला बिना जोड़ी वाला टी परीक्षण। **** पी <0.0001 के बा। नीचे के पैनल: जंगली प्रकार आ GhLag1p उपभेदन में व्यक्त Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI एंकर में मौजूद आईपीसी के एसिली चेन लंबाई के एमएस विश्लेषण। डेटा कुल आईपीसी सिग्नल के प्रतिशत के प्रतिनिधित्व करेला। पांच स्वतंत्र प्रयोग के औसत। त्रुटि बार = एसडी के बा। दू पूंछ वाला बिना जोड़ी वाला टी परीक्षण। ns, महत्वपूर्ण नइखे। पी = 0.9134 के बा। (बी) गैलेक्टोज-प्रेरित Gas1-GFP के व्यक्त करे वाली sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ आ sec31-1lst1Δ कोशिका के प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ के 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट तक इन्क्यूबेट कइल गइल आ ओकरा बाद नियमित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परफॉर्म करे खातिर नीचे पास कइल गइल 24 डिग्री सेल्सियस के बा। सफेद तीर: ईआर गैस1-जीएफपी समूह बा। खुला तीर: बिना क्लस्टर गैस1-जीएफपी पूरा ईआर झिल्ली पर वितरित होला, ईआर विशेषता वाला न्यूक्लियर रिंग धुंधलापन देखावेला। स्केल बार, 5μm के बा। (C) (B) में वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ के मात्रा निर्धारण। पंकटेट Gas1-GFP संरचना वाला कोशिका के औसत प्रतिशत। तीन स्वतंत्र प्रयोग में, n≥300 कोशिका। त्रुटि बार = एसडी के बा। दू पूंछ वाला बिना जोड़ी वाला टी परीक्षण। **** पी <0.0001 के बा।
सीधे एह समस्या के हल करे खातिर, हमनी के sec31-1 तापमान-संवेदनशील उत्परिवर्तित एलील (चित्र 4 आ मूवी S4) के साथ GhLag1 में Gas1-GFP आ Mid2-iRFP के SCLIM विजुअलाइजेशन कइनी जा। ईआर के 37°C पर रखला के बाद आ बाद में 24°C पर रिलीज कइला के बाद, नया संश्लेषित Gas1-GFP के अधिकतर हिस्सा के समूहबद्ध ना कइल गइल आ पूरा ईआर झिल्ली में बितरित ना कइल गइल, जइसे कि परंपरागत सूक्ष्मदर्शी सभ से देखल गइल (चित्र 4, ए आ बी)। एकरे अलावा, ईआरईएस के एगो बड़हन प्रतिशत (67%) में दू तरह के माल भी सामिल बा जे एह में सह-स्थापित होला (चित्र 4D)। चित्र 4C के पैनल 1 आ 2 में ओवरलैपिंग Gas1-GFP आ Mid2-GFP के साथ ERES के दू गो बिसेस उदाहरण देखावल गइल बा। एकरा अलावा दुनो सामान के एकही ईआरईएस में भर्ती कईल गईल (चित्र 4E, पैनल 3 अवुरी फिल्म S4)। एहसे हमनी के नतीजा बतावता कि ईआर झिल्ली में सेरामाइड एसिल चेन के लंबाई ईआर प्रोटीन के एकत्रीकरण अवुरी वर्गीकरण के एगो महत्वपूर्ण निर्धारक ह।
गैलेक्टोज-प्रेरित स्राव, Gas1-GFP (GPI-AP, हरे) आ Mid2-iRFP (TMP, नीला) आ संरचनात्मक ERES-लेबल Sec13-mCherry (ERES, मैजेंटा) के एक्सप्रेस करे वाली Sec31-1 GhLag1 कोशिका सभ के 37°C पर इन्क्यूबेट कइल जाला। 30 मिनट तक जारी रखीं, 24°C तक गिर के स्राव छोड़ीं, आ 20 मिनट के बाद SCLIM से इमेज करीं। (ए से सी) कार्गो आ ईआरईएस से चिन्हित 10 जेड-खंड सभ के प्रतिनिधि 2 डी प्रोजेक्शन इमेज (ए; स्केल बार, 1μm) या 3 डी सेल गोलार्ध छवि (बी आ सी; स्केल यूनिट, 0.45μm)। (B) में निचला पैनल आ (C) में पैनल प्रोसेस कइल छवि सभ के डिस्प्ले करे ला ताकि खाली ERES (मैजेंटा) [Gas1-GFP (ग्रे) आ Mid2-iRFP (हल्का नीला)] में मौजूद सामान सभ के देखावल जा सके। (ग) सफेद भरल तीर: ईआरईएस, माल ओवरलैप होला। खुला तीर: ईआरईएस में खाली एगो आइटम बा। निचला पैनल: चुनल गइल ईआरईएस में ओवरलैपिंग माल (1 आ 2) बा जेकरा के (सी) में चिन्हित कइल गइल बा। स्केल बार, 100 एनएम के बा। (D) (C) में वर्णित फोटोमाइक्रोग्राफ के मात्रा निर्धारण। sec31-1 आ sec31-1 GhLag1 इकाई सभ में, खाली एगो कार्गो (Gas1-GFP या Mid2-iRFP) सामिल कइल जाला, आ अलग-थलग कार्गो आ ओवरलैपिंग कार्गो खातिर ERES के औसत प्रतिशत। तीन स्वतंत्र प्रयोग में, 54 कोशिका (sec31-1) में n = 432 अवुरी 47 कोशिका (sec31-1 GhLag1) में n = 430। त्रुटि बार = एसडी के बा। दू पूंछ वाला बिना जोड़ी वाला टी परीक्षण। *** पी = 0.0002 (sec31-1) अउर ** पी = 0.0031 (sec31-1 GhLag1)। (ई) (सी) में चिह्नित ओवरलैपिंग कार्गो (3) के साथ चयनित ईआरईएस के 3 डी छवि। गैस1-जीएफपी (हरा) आ मिड2-आईआरएफपी (नीला) एकही ओर से ईआरईएस (मैजेंटा) के लगे पहुँच जालें आ एकही ईआरईएस प्रतिबंधित इलाका में रहे लें। स्केल बार, 100 एनएम के बा।
ई अध्ययन सीधा इन विवो सबूत देला कि लिपिड आधारित प्रोटीन कार्गो सभ के स्राव मार्ग में चयनात्मक निर्यात साइट सभ में वर्गीकृत कइल जाला, आ वर्गीकरण चयनात्मकता खातिर एसिल चेन के लंबाई के महत्व के पता चले ला। SCLIM नाम के एगो शक्तिशाली आ अत्याधुनिक माइक्रोस्कोपी तकनीक के इस्तेमाल से, हमनी के खमीर में नवसंश्लेषित Gas1-GFP (बहुत लंबा एसिली श्रृंखला (C26) सेरामाइड लिपिड हिस्सा वाला एगो प्रमुख प्लाज्मा झिल्ली GPI-AP) के प्रदर्शन कइनी जा ) असतत ईआर में समूहबद्ध क्षेत्र विशिष्ट ERES से जुड़ल होला, जबकि ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन पूरा ईआर झिल्ली में वितरित होला (चित्र 1) के बा। एकरे अलावा, ई दुनों प्रकार के सामान अलग-अलग ईआरईएस में चुनिंदा रूप से प्रवेश करे लें (चित्र 2)। झिल्ली में सेलुलर सेरामाइड के एसिल चेन के लंबाई C26 से कम हो के C18-C16 हो जाला, Gas1-GFP क्लस्टर के असतत ईआर क्षेत्र में बिघटन हो जाला आ Gas1-GFP के रिरूट क के ईआर के ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के साथ एकही ERES के माध्यम से छोड़ दिहल जाला (चित्र 3 आ चित्र 3)। 4) के बा।
हालांकि जीपीआई-एपी ईआर से बाहर निकले खातिर एगो विशेष प्रोटीन तंत्र के इस्तेमाल करेला, हमनी के पाता चलल कि सी 26 सेरामाइड-निर्भर अलगाव विभेदक प्रोटीन बातचीत प निर्भर ना करेला जवना से ईआरईएस विशेषज्ञता हो सकता (चित्र S4 अवुरी S5)। एकरा बजाय, हमनी के खोज एगो वैकल्पिक वर्गीकरण तंत्र के समर्थन करेला जवन लिपिड आधारित प्रोटीन क्लस्टरिंग अवुरी बाद में बाकी माल के बहिष्कार से संचालित होखेला। हमनी के निरीक्षण बतावेला कि कवनो विशिष्ट ERES से जुड़ल Gas1-GFP क्षेत्र भा समूह में ट्रांसमेम्ब्रेन स्रावित प्रोटीन Mid2-iRFP के कमी होला, जवन बतावेला कि C26 सेरामाइड-निर्भर GPI-AP समूह संबंधित ERES में ओह लोग के प्रवेश के सुविधा दिही, आ साथे-साथे, ट्रांसमेम्ब्रेन के बाहर कर दी स्राव एह खास ERES में प्रवेश करेला (चित्र 1 आ 2)। एकरे बिपरीत, ईआर झिल्ली में C18-C16 सेरामाइड सभ के मौजूदगी से जीपीआई-एपी के क्षेत्र भा समूह ना बने ला, एह से ई ट्रांसमेम्ब्रेन से स्रावित प्रोटीन सभ के एकही ईआरईएस में बाहर ना करे लें या बदले लें (चित्र 3 आ 4)। . एह से हमनी के प्रस्ताव बा कि C26 सेरामाइड विशिष्ट ERES से जुड़ल प्रोटीन सभ के क्लस्टरिंग के सुविधा दे के अलगाव आ वर्गीकरण के चलावे ला।
ई C26 सेरामाइड-निर्भर क्लस्टरिंग के एगो विशिष्ट ईआर क्षेत्र में कइसे हासिल कइल जा सकेला? झिल्ली सेरामाइड के पार्श्व रूप से अलग होखे के प्रवृत्ति के कारण जीपीआई-एपी आ सी 26 सेरामाइड के छोट आ असंतृप्त ग्लिसरॉलिपिड वाला ईआर झिल्ली के अधिका अनियमित लिपिड वातावरण में छोट आ तुरंत क्रमबद्ध लिपिड बनावल जा सके ला। गुणवत्ता के समूह (17, 18) के बा। ई छोट अस्थायी समूह सभ के p24 परिसर ( 34 ) से जुड़ला के बाद अउरी बड़हन, ढेर स्थिर समूह सभ में फ्यूज कइल जा सके ला। एकरा अनुरूप, हमनी के देखवनी जा कि C26 Gas1-GFP के बड़ लउके वाला समूह बनावे खातिर p24 परिसर के साथ बातचीत करे के जरूरत बा (चित्र 3)। p24 परिसर एगो हेटरोजाइगस ओलिगोमर हवे जे खमीर ( 35 ) में चार गो अलग-अलग p24 ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन सभ से बनल होला, जवन बहुसंयोजक बाइंडिंग प्रदान करे ला, जेकरा चलते छोट जीपीआई-एपी समूह सभ के क्रॉस-लिंकिंग हो सके ला, जेकरा से बड़हन स्टेबल क्लस्टर पैदा हो सके ला (34)। जीपीआई-एपी सभ के प्रोटीन एक्टोडोमेन सभ के बीच के परस्पर क्रिया भी इनहन के एकट्ठा होखे में योगदान दे सके ले, जइसे कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका सभ में इनहन के गोल्गी परिवहन के दौरान देखावल गइल बा ( 36 )। हालाँकि, जब ईआर झिल्ली में C18-C16 सेरामाइड मौजूद होखे तब जब p24 कॉम्प्लेक्स Gas1-GFP से जुड़ जाला तब बड़हन अलग-अलग समूह ना बने ला। अंतर्निहित तंत्र लंबा एसिल चेन वाला सेरामाइड के बिसेस भौतिक आ रासायनिक गुण सभ पर निर्भर हो सके ला। कृत्रिम झिल्ली सभ के जैव भौतिक अध्ययन से पता चले ला कि हालाँकि, लंबा (C24) आ छोट (C18-C16) दुनों तरह के एसिली चेन सेरामाइड सभ फेज अलगाव के कारण हो सके लें, खाली लंबा एसिल चेन सेरामाइड (C24) ही फिलिम के नया आकार देवे खातिर हाई कर्वचर आ फिलिम बेंडिंग के बढ़ावा दे सके लें। आपसी संदर्भ के माध्यम से (17, 37, 38)। ई देखावल गइल बा कि TMED2 के ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स, Emp24 के मानव होमोलॉग, साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल में C18 सेरामाइड आधारित स्फिंगोमाइलिन के साथ चुनिंदा रूप से बातचीत करे ला ( 39 )। आणविक गतिकी (एमडी) सिमुलेशन के इस्तेमाल से, हमनी के पाता चलल कि C18 अवुरी C26 दुनो सेरामाइड Emp24 ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स के साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल के आसपास जमा होखेला, अवुरी एकर पसंद समान बा (चित्र S6)। इहाँ ई बतावल जाय कि ई बतावे ला कि Emp24 के ट्रांसमेम्ब्रेन हेलिक्स के कारण झिल्ली में लिपिड सभ के असममित बितरण हो सके ला। ई स्तनधारी कोशिका सभ पर आधारित हालिया परिणाम हवे। समान एमडी सिमुलेशन भी ईथर लिपिड (40) के मौजूदगी देखावेला। एह से हमनी के अनुमान बा कि ER26 के दुनो लोब्यूल में C26 सेरामाइड स्थानीय रूप से समृद्ध बा। जब लुमिनल लोब्यूल सभ में जीपीआई-एपी सीधे मल्टीवैलेंट पी 24 से जुड़ जाला आ साइटोप्लाज्मिक लोब्यूल सभ में पी 24 के आसपास सी 26 सेरामाइड के जमाव होला तब ई एकरे साथ होखे वाला प्रोटीन के एकट्ठा होखे के बढ़ावा दे सके ला आ झिल्ली के वक्रता अँगुरी सभ के माध्यम से पैदा हो सके ला (41), जेकरा चलते जीपीआई-एपी ईआरईएस से सटल असतत इलाका सभ में अलग हो जाला, जवन भी बहुत घुमावदार इलाका सभ के पक्ष में होला ईआर झिल्ली के क्षेत्र ( 42 ) के बा। पिछला रिपोर्ट प्रस्तावित तंत्र के समर्थन करत रहे ( 43 , 44 )। प्लाज्मा झिल्ली पर सेरामाइड आधारित ग्लाइकोस्फिंगोलिपिड (GSL) के साथ ओलिगोलेक्टिन, रोगजनक भा एंटीबॉडी सभ के बहुसंयोजक बाइंडिंग से बड़हन जीएसएल एकट्ठा होखे के सुरुआत होला, फेज अलगाव बढ़ जाला आ झिल्ली के बिरूपण आ इंटरनलाइजेशन होला ( 44 )। इवाबुची इत्यादि (43) ई पावल गइल कि लंबा (C24) बाकी छोट ना (C16) एसिल चेन सभ के मौजूदगी में जीएसएल लैक्टोसाइलसेरामाइड से जुड़ल बहुसंयोजक लिगांड बड़हन समूह आ झिल्ली के आक्रमण के पैदा करे ला आ पत्रक सभ पर साइटोप्लाज्म लिन-मध्यस्थता वाला सिग्नल ट्रांसडक्शन के युग्मित में एसिल चेन सभ द्वारा इंटरडिजिटेशन कइल जाला न्यूट्रोफिल के नाम से जानल जाला।
स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका सभ में, एपिकल प्लाज्मा झिल्ली के स्तर तक ले एंटी-गोल्गी नेटवर्क (TGN) के एकाग्रता जीपीआई-एपी के अलगाव आ छँटाई के नियंत्रित करे ले ( 10 , 45 )। ई एकट्ठा होखे के कारण जीपीआई-एपी ओलिगोमेराइजेशन ( 36 ) होला, बाकी ई खमीर में मिले वाला सेरामाइड चेन के लंबाई पर भी निर्भर हो सके ला। हालाँकि, स्तनधारी जीपीआई-एपी में ईथर लिपिड आधारित एंकर होला, आ एकर रासायनिक संरचना बहुत लंबा एसिली चेन सेरामाइड से बहुत अलग होला, हाल के अध्ययन में पावल गइल कि दुनों लिपिड सभ के बिकास के हिसाब से भौतिक आ रासायनिक गुण आ कामकाज एकही नियर होला ( 40 )। एह से स्तनधारी कोशिका सभ में ईथर लिपिड के हिस्सा खमीर में मौजूद C26 सेरामाइड नियर हो सके ला आ एकर भूमिका जीपीआई-एपी के एकट्ठा होखे आ छँटाई के बढ़ावा देवे खातिर झिल्ली में लंबा श्रृंखला वाला सेरामाइड से जुड़ल होला। हालाँकि, एह संभावना के अबहिन सीधे परीक्षण करे के जरूरत बा, पहिले के खोज सभ एह बात के समर्थन करे लें कि गोल्गी बॉडी में लंबा एसिल चेन वाला सेरामाइड के परिवहन साइटोप्लाज्मिक ट्रांसफर प्रोटीन सभ द्वारा ना होला बलुक ई खमीर नियर जीपीआई एंकर सभ के संश्लेषण पर निर्भर करे ला। एह से, बिकासवादी रूढ़िवादी तंत्र बहुत लंबा एसिली चेन सेरामाइड आ जीपीआई-एपी (13, 16, 20, 46, 47) के एकही परिवहन पुटिका में चुनिंदा रूप से सह-परिवहन करे में सक्षम लउके ला।
खमीर आ स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका सिस्टम सभ में जीपीआई-एपी के एकट्ठा होखे आ अन्य प्लाज्मा झिल्ली प्रोटीन सभ से अलग होखल सभ कोशिका के सतह पर पहुँचे से पहिले होला। पलाडिनो एट अल के बा। (48) के खोज में पावल गइल कि स्तनधारी ध्रुवीकृत उपकला कोशिका सभ के टीजीएन पर, जीपीआई-एपी क्लस्टरिंग ना खाली एपिकल प्लाज्मा झिल्ली में जीपीआई-एपी सभ के चयनात्मक वर्गीकरण खातिर जरूरी बा, बलुक जीपीआई-एपी सभ के क्लस्टरिंग संगठन आ एकरे जैविक गतिविधि के भी नियंत्रित करे ला। कोशिका के सतह के बारे में बतावल गइल बा। खमीर में, एह अध्ययन से पता चलल कि ईआर पर सी 26 सेरामाइड-निर्भर जीपीआई-एपी क्लस्टर प्लाज्मा झिल्ली पर जीपीआई-एपी के क्लस्टर संगठन आ कामकाजी गतिविधि के नियंत्रित क सके ला ( 24 , 49 )। एह मॉडल के अनुरूप, GhLag1 कोशिका सभ के जीपीआई अवरोधक भा दवाई सभ से एलर्जी होला जे कोशिका भित्ति के अखंडता के प्रभावित करे लीं ( 28 ), आ खमीर कोशिका सभ के संभोग में प्रोजेक्टेड टिप सेरामाइड के कामकाजी Gas1-GFP समूह ( 49 ) के जरूरत जी के संकेत देला hLag1 कोशिका सभ के संभावित शारीरिक परिणाम। जीपीआई-एपी त्रुटि के बा। हालांकि, आगे के परीक्षण कईल कि कोशिका के सतह के कार्यात्मक संगठन के लिपिड के लंबाई के आधार प छंटाई के तरीका से ईआर से प्रोग्राम कईल गईल बा कि ना, इ हमनी के भविष्य के शोध के विषय होई।
एह काम में इस्तेमाल कइल गइल सैकरोमाइसिस सेरेविसिया उपजाति सभ के तालिका S1 में दिहल गइल बा। लाइव सेल इमेजिंग खातिर SCLIM के MMY1583 आ MMY1635 उपजाति के निर्माण W303 के पृष्ठभूमि में कइल गइल। फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग के साथ Sec13-mCherry के एक्सप्रेस करे वाला ई उपभेद सभ के निर्माण टेम्पलेट के रूप में pFA6a प्लाज्मिड के साथ पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित तरीका के इस्तेमाल से कइल गइल ( 23 )। GAL1 प्रोमोटर के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट प्रोटीन से लेबल Mid2-iRFP के एक्सप्रेस करे वाला तनाव के निर्माण निम्नलिखित तरीका से कइल गइल। pKTiRFP-KAN वेक्टर (ई. ओ'शी, एडजीन प्लाज्मिड नंबर 64687 के उपहार; http://n2t.net/addgene: 64687; रिसर्च रिसोर्स आइडेंटिफायर (RRID): Addgene_64687) से iRFP-KanMx अनुक्रम के पीसीआर प्रवर्धन आ अंतर्जात Mid2 के C-टर्मिनस में डालल गइल। Mid2-iRFP जीनोम सीक्वेंस के एम्पलीफाई आ GAL1 प्रोमोटर में क्लोन कइला के बाद एकरा के इंटीग्रेशन प्लाज्मिड pRS306 के Not I-Sac I साइट में एकीकरण कइल गइल। परिणामस्वरूप प्लाज्मिड pRGS7 के Pst I के साथ रेखीय बनावल गइल ताकि URA3 लोकस में एकीकृत हो सके।
Gas1-GFP फ्यूजन जीन के एक्सप्रेस सेंट्रोमेर (CEN) प्लाज्मिड में GAL1 प्रोमोटर के नियंत्रण में होला, जेकर निर्माण निम्नलिखित तरीका से होला। Gas1-GFP अनुक्रम के pRS416-GAS1-GFP प्लाज्मिड (24) (एल. पोपोलो के उपहार) से पीसीआर द्वारा प्रवर्धित कइल गइल आ CEN प्लाज्मिड pBEVY-GL LEU2 (सी के उपहार) के Xma I–Xho I साइट में क्लोन कइल गइल। मिलर के नाम से जानल जाला; एडजीन प्लाज्मिड नंबर 51225 बा; http://n2t.net/addgene: 51225 पर दिहल गइल बा; आरआरआईडी: एडजीन_51225) के बा। एकरे परिणामस्वरूप बनल प्लाज्मिड के नाँव pRGS6 रखल गइल। Axl2-GFP फ्यूजन जीन भी pBEVY-GL LEU2 वेक्टर के GAL1 प्रोमोटर के नियंत्रण में एक्सप्रेस होला आ एकर निर्माण निम्नलिखित होला। Axl2-GFP अनुक्रम के पीसीआर द्वारा pRS304-p2HSE-Axl2-GFP प्लाज्मिड (23) से प्रवर्धित कइल गइल, आ pBEVY-GL LEU2 वेक्टर के Bam HI-Pst I साइट में क्लोन कइल गइल। एकरे परिणामस्वरूप बनल प्लाज्मिड के नाँव pRGS12 रखल गइल। एह अध्ययन में इस्तेमाल कइल गइल ओलिगोन्यूक्लिओटाइड सभ के अनुक्रम तालिका S2 में दिहल गइल बा।
एह तनाव के 0.2% एडेनिन आ 2% ग्लूकोज [YP-dextrose (YPD)], 2% रैफिनोज [YP-raffinose] रिच खमीर अर्क प्रोटीन पी (YP) मीडियम (1 % खमीर अर्क आ 2% प्रोटीन ept) के पूरक दिहल गइल। (YPR)] या 2% गैलेक्टोज [YP-गैलेक्टोज (YPG)] कार्बन स्रोत के रूप में, या सिंथेटिक न्यूनतम माध्यम (0.15% खमीर नाइट्रोजन बेस आ 0.5% अमोनियम सल्फेट) में पोषण खातिर जरूरी अमीनो एसिड आ बेस के पूरक बनावे खातिर , आ 2% ग्लूकोज (सिंथेटिक ग्लूकोज न्यूनतम माध्यम) या 2% गैलेक्टोज वाला (सिंथेटिक गैलेक्टोज न्यूनतम माध्यम) के कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल कइल जाला।
रियल-टाइम इमेजिंग खातिर, GAL1 प्रोमोटर के तहत निर्माण के एक्सप्रेस करे वाली तापमान-संवेदनशील sec31-1 उत्परिवर्तित कोशिका सभ के YPR मीडियम में 24°C पर रात भर मिड-लॉग फेज ले बढ़ावल गइल। 24 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा ले वाईपीजी में इंडक्शन के बाद, कोशिका सभ के 37 डिग्री सेल्सियस पर एसजी में 30 मिनट ले इन्क्यूबेट कइल गइल, आ फिर 24 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित क के स्राव ब्लॉक से रिलीज कइल गइल। कांच के स्लाइड पर कोशिका के ठीक करे खातिर कॉनकानावेलिन ए के इस्तेमाल कइल गइल आ एससीएलआईएम द्वारा इमेजिंग कइल गइल। SCLIM ओलंपस IX-71 उलटा फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोप आ UPlanSApo 100×1.4 न्यूमेरिकल एपर्चर ऑयल लेंस (ओलंपस), हाई-स्पीड आ हाई-सिग्नल-टू-नॉइज रेशियो रोटेटिंग डिस्क कॉनफोकल स्कैनर (योकोगावा इलेक्ट्रिक), कस्टम स्पेक्ट्रोमीटर, आ कस्टम कूलिंग के संयोजन हवे The system's image intensifier (Hamamatsu फोटोनिक्स) ×266.7 के अंतिम आवर्धन वाला मैग्नीफाइंग लेंस सिस्टम आ चार्ज-कपल्ड डिवाइस कैमरा उपलब्ध करा सके ला जे इलेक्ट्रॉन सभ के गुणा करे ला (हमामात्सु फोटोनिक्स) (21)। छवि अधिग्रहण कस्टम सॉफ्टवेयर (योकोगावा इलेक्ट्रिक) द्वारा कइल जाला। 3D इमेज खातिर, हमनी के ऑब्जेक्टिव लेंस के लंबवत रूप से कंपन करे खातिर कस्टम-मेड पीजोइलेक्ट्रिक एक्ट्यूएटर के इस्तेमाल कईनी, अवुरी ऑप्टिकल पार्ट के 100 एनएम के अंतर से ढेर में एकट्ठा कईनी। जेड-स्टैक इमेज के 3D वोक्सेल डेटा में बदल दिहल जाला आ घूमत डिस्क कॉनफोकल माइक्रोस्कोप खातिर इस्तेमाल होखे वाला सैद्धांतिक बिंदु बिस्तार फंक्शन के इस्तेमाल वोलोसिटी सॉफ्टवेयर (पर्किनएलमर) द्वारा डिकॉनवोल्यूशन प्रोसेसिंग खातिर कइल जाला। को-लोकेशन एनालिसिस खातिर स्वचालित रूप से थ्रेसहोल्ड करे खातिर वोलोसिटी सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल से कार्गो समेत ईआरईएस के मापल गइल। लाइन स्कैन विश्लेषण मेटामोर्फ सॉफ्टवेयर (मोलेकुलर डिवाइसेज) के उपयोग से कइल गइल।
सांख्यिकीय महत्व के निर्धारण खातिर ग्राफपैड प्रिज्म सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल करीं। दू-पूंछ वाला स्टूडेंट के टी-टेस्ट आ साधारण एकतरफा विचरण के विश्लेषण (एनोवा) परीक्षण खातिर, समूह सभ के बीच के अंतर के पी <0.05 (*) पर काफी परभाव मानल जाला।
Gas1-GFP के फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी खातिर, लॉग फेज कोशिका सभ के YPD में रात भर बढ़ावल गइल आ सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा एकट्ठा कइल गइल, फॉस्फेट बफर खारा से दू बेर धोवल गइल, आ बर्फ पर कम से कम 15 मिनट ले इन्क्यूबेट कइल गइल, आ फिर माइक्रोस्कोप के तहत आगे बढ़ल गइल जइसे कि पहिले बतावल गइल बा चेक (24)। अधिग्रहण खातिर ऑब्जेक्टिव लेंस, एल 5 (जीएफपी) फिल्टर, हमामात्सु कैमरा अवुरी एप्लीकेशन सूट एक्स (एलएएस एक्स) सॉफ्टवेयर से लैस लीका डीएमआई8 माइक्रोस्कोप (एचसीएक्स पीएल एपीओ 1003/1.40 ऑयल पीएच3 सीएस) के इस्तेमाल कईल गईल। .
नमूना सभ के 65°C पर 10 मिनट ले एसडीएस नमूना बफर से विकृत कइल गइल, आ फिर एसडीएस-पॉलीएक्रीलामाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (PAGE) द्वारा अलग कइल गइल। इम्यूनोब्लॉटिंग विश्लेषण खातिर, प्रति लेन 10 μl नमूना लोड कइल गइल। प्राथमिक एंटीबॉडी: खरगोश के पॉलीक्लोनल एंटी-गैस1 के 1:3000 के पतलापन में, खरगोश के पॉलीक्लोनल एंटी-Emp24 के 1:500 के पतलापन में, आ खरगोश के पॉलीक्लोनल एंटी-जीएफपी (एच. रिजमैन के उपहार) के 1:3000 के पतलापन में इस्तेमाल करीं। माउस मोनोक्लोनल एंटी-Pgk1 एंटीबॉडी के इस्तेमाल 1:5000 (जे. डे ला क्रूज के उपहार) के पतलापन पर कइल गइल। सेकेंडरी एंटीबॉडी: हॉर्सरैडिश पेरोक्साइडेज (HRP) संयुग्मित बकरी एंटी-खरगोश इम्यूनोग्लोबुलिन जी (IgG) के इस्तेमाल 1:3000 (पियर्स) के पतलापन पर कइल जाला। एचआरपी-संयुग्मित बकरी एंटी-माउस आईजीजी के इस्तेमाल 1:3000 (पियर्स) के पतलापन पर कइल गइल। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्षेत्र के सुपरसिग्नल वेस्ट पिको अभिकर्मक (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के केमिलुमिनेसेंस विधि से देखल गइल।
जइसन कि (31) में वर्णित बा, समृद्ध ईआर अंश पर प्राकृतिक इम्यूनोप्रीसिपिटेशन प्रयोग कइल गइल। संक्षेप में, खमीर कोशिका सभ के TNE बफर [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM फिनाइलमिथाइलसल्फोनाइल फ्लोराइड आ प्रोटीज इनहिबिटर मिश्रण) से 600 nm ( OD600) पर 100 ऑप्टिकल घनत्व पर दू बेर धोईं। एकरा के कांच के मोती से तोड़ल गइल, आ ओकरा बाद कोशिका के मलबा आ कांच के मोती के सेंट्रीफ्यूजेशन से हटा दिहल गइल। एकरे बाद सुपरनेटेंट के 17,000 ग्राम पर 4°C पर 15 मिनट ले सेंट्रीफ्यूज कइल गइल। गोली के टीएनई में फिर से लटका दिहल गइल आ डिजिटलिस सैपोनिन के अंतिम एकाग्रता 1% तक मिलावल गइल। निलंबन के 4°C पर घुमाव के साथ 1 घंटा ले इन्क्यूबेट कइल गइल, आ फिर अघुलनशील घटक सभ के 13,000 g पर 4°C पर 60 मिनट ले सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिहल गइल। Gas1-GFP इम्यूनोप्रेसिपिटेशन खातिर, पहिले नमूना के खाली अगरोज बीड्स (ChromoTek) के साथ 4°C पर 1 घंटा ले प्री-इन्क्यूबेट करीं, आ फिर GFP-Trap_A (ChromoTek) के साथ 4°C पर 3 घंटा ले इन्क्यूबेट करीं। इम्यूनोप्रेसिपिटेटेड बीड्स के 0.2% डाइगोक्सिजेनिन वाला TNE से पांच बेर धो के एसडीएस नमूना बफर से इल्यूट कइल गइल, एसडीएस-पीएजीई पर अलग कइल गइल आ इम्यूनोब्लॉटिंग से विश्लेषण कइल गइल।
जइसन कि (31) में वर्णित बा, क्रॉस-लिंकिंग निर्धारण समृद्ध ईआर अंश पर कइल गइल। संक्षेप में, समृद्ध ईआर अंश के 0.5 एमएम डाइथियोबिस (सुक्सिनिमिडाइल प्रोपिओनेट) (पियर्स, थर्मो फिशर साइंटिफिक, रॉकफोर्ड, आईएल, अमेरिका; 20 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट) के साथ इनक्यूबेट कइल गइल। क्रॉसलिंकिंग रिएक्शन के ग्लाइसिन (50 मिमी अंतिम एकाग्रता, 5 मिनट, 20 डिग्री सेल्सियस) मिला के बुझावल गइल।
जइसन कि पहिले बतावल गइल बा (50), जंगली प्रकार आ GhLag1 उपभेदन में सेरामाइड के एमएस विश्लेषण कइल गइल। संक्षेप में, कोशिका सभ के 30°C पर वाईपीडी में घातीय चरण (3 से 4 OD600 यूनिट/एमएल) तक बढ़ावल गइल, आ 25×107 कोशिका सभ के कटाई कइल गइल। इनहन के मेटाबॉलिज्म ट्राइक्लोरोएसिटिक एसिड से बुझावल जाला। निष्कर्षण विलायक [इथेनॉल, पानी, ईथर, पाइरिडीन आ 4.2 N अमोनियम हाइड्रॉक्साइड (15:15:5:1:0.018 v/v)] आ आंतरिक मानक C17 सेरामाइड (860517, अवंटी पोलर लिपिड) क्वालिटी के 1.2 एनएमओएल के इस्तेमाल करीं। अर्क के हल्का क्षारीय जलविघटन करे खातिर मोनोमिथाइलमाइन अभिकर्मक [मेथनॉल, पानी, एन-ब्यूटानॉल आ मिथाइलमाइन घोल (4:3:1:5 v/v)] के इस्तेमाल करीं, आ फिर नमक के हटावे खातिर पानी से संतृप्त एन-ब्यूटानॉल के इस्तेमाल करीं। अंत में, अर्क के पॉजिटिव मोड सॉल्वेंट [क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल/पानी (2:7:1) + 5 mM अमोनियम एसीटेट] में फिर से लटका दिहल गइल आ मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट कइल गइल। स्फिंगोलिपिड अणु के पहचान आ मात्रा निर्धारण खातिर मल्टी-रिएक्शन मॉनिटरिंग (एमआरएम) कइल गइल। टीएसक्यू वैंटेज तृतीयक चतुर्ध्रुवीय मास स्पेक्ट्रोमीटर (थर्मो फिशर साइंटिफिक) में लिपिड विश्लेषण खातिर रोबोटिक नैनोफ्लो आयन स्रोत नैनोमेट एचडी (एडविओन बायोसाइंसेज, इथाका, एनवाई) लगावल गइल बा। टक्कर ऊर्जा के हर सेरामाइड श्रेणी खातिर अनुकूलित कइल गइल बा। एमएस डेटा पॉजिटिव मोड में प्राप्त कइल गइल। हर जैविक प्रतिकृति खातिर, लिपिड सिग्नल तीन गो स्वतंत्र माप सभ के मीडियन होला।
जइसन कि (31) में बतावल गइल बा, Gas1-GFP के एक्सप्रेस करे वाली कोशिका (800×107) के प्राकृतिक इम्यूनोप्रेसिपिटेशन के अधीन कइल गइल। शुद्ध Gas1-GFP के SDS-PAGE द्वारा अलग कइल गइल आ पॉलीविनाइलडीन फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली में स्थानांतरित कइल गइल। प्रोटीन के एमाइड ब्लैक से पीवीडीएफ के रंगाई से विजुअलाइज कइल गइल। Gas1-GFP बैंड के PVDF से काट के 5 बेर मेथनॉल से आ एक बेर लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-MS (LC-MS) ग्रेड के पानी से धोवल गइल। झिल्ली पट्टी के 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), बफर आ 500μl ताजा घुलल 1 M सोडियम नाइट्राइट मिश्रण के साथ 37°C पर 3 घंटा ले इन्क्यूबेट क के, लिपिड अंश के Gas1-GFP से रिलीज कइल जाला आ ग्लूकोसामाइन आ इनोसिटोल (51) के बीच इनोसाइने फॉस्फेट सेरामाइड के रिलीज के लाइस कइल जाला। एकरे बाद झिल्ली के पट्टी के एलसी-एमएस ग्रेड के पानी से चार बेर धो के कमरा के तापमान पर सुखावल गइल आ नाइट्रोजन के वातावरण में -80°C पर बिस्लेषण तक ले संग्रहित कइल गइल। नियंत्रण के रूप में हर प्रयोग खातिर पीवीडीएफ झिल्ली के खाली नमूना के इस्तेमाल कइल गइल। एकरा बाद Gas1-GFP से निकालल लिपिड के एमएस द्वारा विश्लेषण कइल गइल जइसन कि वर्णित बा ( 50 )। संक्षेप में, जीपीआई-लिपिड वाला पीवीडीएफ पट्टी सभ के 75μl नेगेटिव मोल्ड सॉल्वेंट [क्लोरोफॉर्म/मेथनॉल (1:2) + 5 एमएम अमोनियम एसीटेट] में फिर से लटका दिहल गइल आ इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई)-एमआरएम/एमएस स्फिंगोलिपिड प्रजाति सभ के बिस्लेषण (टीएसक्यू वैंटेज) पास कइल गइल। एह मामला में एमएस डेटा नेगेटिव आयन मोड में मिलल।
जइसन कि पहिले बतावल गइल बा, जीपीआई एंकर के लिपिड हिस्सा के [3H]-इनोसिटोल-लेबल जीपीआई-एपी (16) से अलग कइल गइल। लिपिड सभ के सॉल्वेंट सिस्टम (55:45:10 क्लोरोफॉर्म-मेथनॉल-0.25% KCl) के इस्तेमाल से पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग कइल गइल आ FLA-7000 (Fujifilm) के इस्तेमाल से बिजुअलाइज कइल गइल।
Gas1-GFP (600×107) के एक्सप्रेस करे वाली कोशिका सभ के TNE बफर से TNE बफर से दू बेर धोवल गइल, आ कांच के बीड्स से तोड़ल गइल, आ फिर सेल के मलबा आ कांच के बीड्स के हटावे खातिर सेंट्रीफ्यूज कइल गइल। एकरे बाद सुपरनेटेंट के 17,000 ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा ले सेंट्रीफ्यूज कइल गइल। गोली के TNE में धो के 0.2% डिजिटलिस सैपोनिन वाला TNE में 1 U PI-PLC (Invitrogen) के साथ 37°C पर 1 घंटा तक इन्क्यूबेट कइल गइल। एंजाइम उपचार के बाद, झिल्ली के 17,000 ग्राम पर 4°C पर 1 घंटा तक सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिहल गइल। Gas1-GFP के इम्यूनोप्रेसिपिटेट करे खातिर, सुपरनेटेंट के GFP-Trap_A (ChromoTek) के साथ 4°C पर रात भर इन्क्यूबेट कइल गइल। SDS-PAGE द्वारा अलग कइल गइल शुद्ध Gas1-GFP के कूमासी ब्रिलियंट ब्लू से रंगल गइल। Gas1-GFP धुंधलापन बैंड के एक्वाडक्ट के आसपास के ग्रे से काट दिहल गइल, आ फिर आयोडोएसिटामाइड से अल्काइलेशन आ डाइथियोथ्राइटोल से रिडक्शन के बाद, ट्रिप्सिन के साथ इन-जेल पाचन कइल गइल। जीपीआई-ग्लाइकन के साथ ट्रिप्टिक पेप्टाइड आ पेप्टाइड के निकालल आ सुखावल। सूखे पेप्टाइड के 20 μl पानी में घोल दिहल गइल। एलसी में एक हिस्सा (8μl) के इंजेक्शन लगाईं। बिसेस ढाल के स्थिति में पेप्टाइड सभ के अलग करे खातिर ऑक्टाडेसिलसिलेन (ODS) कॉलम (डेवेलोसिल 300ODS-HG-5; भीतरी व्यास 150 मिमी×1.0 मिमी; नोमुरा केमिकल, ऐची प्रांत, जापान) के इस्तेमाल कइल गइल। मोबाइल फेज में विलायक ए (0.08% फॉर्मिक एसिड) आ विलायक बी (80% एसीटोनिट्राइल में 0.15% फॉर्मिक एसिड) होला। एक्सेला एचपीएलसी सिस्टम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, बोस्टन, मैसाचुसेट्स) के इस्तेमाल से कॉलम के विलायक ए से 55 मिनट के भीतर 50 μl min-1 के प्रवाह दर पर 5 मिनट खातिर इल्यूट कइल गइल, आ फिर विलायक बी के एकाग्रता 40% तक बढ़ा दिहल गइल। , संयुक्त राज्य अमेरिका के ह)। इल्यूएट के लगातार ईएसआई आयन स्रोत में डालल गइल आ जीपीआई-ग्लाइकन वाला ट्रिप्टिक पेप्टाइड आ पेप्टाइड सभ के एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल (हाइब्रिड रेखीय आयन ट्रैप-ऑर्बिट्राप मास स्पेक्ट्रोमीटर; थर्मो फिशर साइंटिफिक) द्वारा बिस्लेषण कइल गइल। एमएस सेटअप में केशिका स्रोत के वोल्टेज 4.5 केवी पर सेट कइल गइल, आ ट्रांसफर केशिका के तापमान 300°C पर रखल गइल। केशिका वोल्टेज आ ट्यूब लेंस वोल्टेज क्रमशः 15 वी आ 50 वी पर सेट कइल गइल। एमएस डेटा 300/m/z द्रव्यमान/चार्ज अनुपात (m/z) 3000 के द्रब्यमान रेंज में पॉजिटिव आयन मोड (60,000 के रिजोल्यूशन; 10 पार्ट प्रति मिलियन के द्रब्यमान सटीकता) में मिलल।एमएस/एमएस डेटा एलटीक्यू ऑर्बिट्रैप एक्सएल में आयन ट्रैप के माध्यम से मिलल [पहिला 3 अंक जवना पर डेटा निर्भर बा, टक्कर से पैदा होखे वाला बिच्छेद (सीआईडी) के बा]।
एमडी सिमुलेशन ग्रोमैक्स (52) सॉफ्टवेयर आ मार्टिनी 2 फोर्स फील्ड (53-55) के इस्तेमाल से कइल गइल। एकरे बाद CHARMM GUI मेम्ब्रेन बिल्डर (56, 57) के इस्तेमाल डाइओलियोइलफॉस्फेटिडाइलकोलाइन (DOPC) आ Cer C18 या DOPC आ Cer C26 वाला बिलेयर बनावे खातिर कइल गइल। Cer C26 के टोपोलॉजी आ निर्देशांक स्फिंगोसिन टेल से अतिरिक्त बीड्स के हटा के DXCE से निकालल जाला। डबल लेयर के संतुलन बनावे आ ओकरा के चलावे खातिर नीचे बतावल प्रक्रिया के इस्तेमाल करीं, फिर सिस्टम के अंतिम निर्देशांक के इस्तेमाल करीं आ Emp24 वाला सिस्टम बनाईं। खमीर Emp24 (अवशेष 173 से 193) के ट्रांसमेम्ब्रेन डोमेन के निर्माण विजुअल एमडी (वीएमडी) उपकरण आणविक संरचना ( 58 ) के उपयोग से α-हेलिक्स के रूप में कइल गइल। एकरे बाद, ओवरलैपिंग लिपिड सभ के हटावे के बाद, प्रोटीन के मोट दानेदार बना के CHARMM GUI के इस्तेमाल से बिलेयर में डालल गइल। अंतिम सिस्टम में 1202 डीओपीसी अवुरी 302 सेर सी26 चाहे 1197 डीओपीसी अवुरी 295 सेर सी18 अवुरी इम्प24 बा। सिस्टम के 0.150M के एकाग्रता तक आयनित करीं। दू गो द्विपरत रचना खातिर चार गो स्वतंत्र प्रतिकृति बनावल गइल।
लिपिड बिलेयर के संतुलित कइल जाला CHARMM GUI प्रक्रिया के इस्तेमाल से, जवना में 405,000 स्टेप के कम से कम कइल जाला आ फिर संतुलन बनावल जाला, जहाँ पोजीशन के बाधा धीरे-धीरे कम हो जाला आ खतम हो जाला आ समय के स्टेप के 0.005 पीएस से बढ़ा के 0.02 पीएस कर दिहल जाला। संतुलन के बाद ई 0.02 पीएस के समय स्टेप के साथ 6 μs पैदा करे ला। Emp24 डालला के बाद, सिस्टम के कम से कम आ संतुलन बनावे खातिर उहे CHARMM GUI प्रक्रिया के इस्तेमाल करीं, आ ओकरा बाद उत्पादन में 8 s तक चलाईं।
सभ सिस्टम सभ खातिर, संतुलन प्रक्रिया के दौरान, दबाव के नियंत्रण बेरेंडसन बैरोस्टेट (59) द्वारा कइल जाला, आ उत्पादन प्रक्रिया के दौरान, दबाव के नियंत्रण पैरिनेल-रहमान बैरोस्टेट (60) द्वारा कइल जाला। सभ मामला में औसत दबाव 1 बार होला आ अर्ध-समरूप दबाव युग्मन योजना के इस्तेमाल कइल जाला। संतुलन आ उत्पादन प्रक्रिया में, गति रिकैलिब्रेशन वाला थर्मोस्टेट (61) के इस्तेमाल क्रम से प्रोटीन, लिपिड आ सॉल्वेंट कण सभ के तापमान के जोड़े खातिर कइल जाला। पूरा ऑपरेशन के दौरान लक्ष्य तापमान 310K बा। गैर-बॉन्डिंग इंटरैक्शन के गणना 0.005 बफर टॉलरेंस वाला वर्लेट योजना के इस्तेमाल से पेयरिंग लिस्ट बना के कइल जाला। कूलंब पद के गणना रिएक्शन फील्ड आ 1.1 एनएम के कट-ऑफ दूरी के इस्तेमाल से कइल जाला। वैंडर वाल्स शब्द में 1.1 एनएम के कट-ऑफ दूरी वाला कट-ऑफ योजना के इस्तेमाल होला आ वर्लेट कट-ऑफ योजना के इस्तेमाल संभावित बहाव खातिर कइल जाला (62)।
वीएमडी के इस्तेमाल से डीओपीसी फॉस्फेट बीड्स भा सेरामाइड एएम1 बीड्स आ प्रोटीन के बीच के कटऑफ तरंग दैर्ध्य 0.7 एनएम होला आ प्रोटीन के साथ परस्पर क्रिया करे वाला लिपिड सभ के संख्या के गणना कइल जाला। निम्नलिखित सूत्र के अनुसार, (63) के अनुसार डिप्लीशन-एन्रिचमेंट (DE) कारक के गणना करीं: DE कारक = (प्रोटीन में कुल लिपिड के मात्रा 0.7) प्रोटीन में 0.7 (कुल लिपिड में Cer के मात्रा)
रिपोर्ट कइल मान औसत के रूप में मिलल बा, आ त्रुटि बार एसई के चार गो स्वतंत्र प्रति हवें। डीई कारक के सांख्यिकीय महत्व के गणना टी परीक्षण [(औसतडीई-कारक-1)/एसई] द्वारा कइल जाला। एक पूंछ वाला वितरण से पी मान के गणना करीं।
ग्रोमैक्स टूल के इस्तेमाल ट्रेस के अंतिम 250 ns के भीतर Emp24 वाला सिस्टम के 2D लैटरल डेन्सिटी मैप के गणना करे खातिर कइल गइल। सेरामाइड के संवर्धन/क्षय के नक्शा पावे खातिर Cer के घनत्व के नक्शा के Cer आ DOPC के नक्शा के योग से भाग दिहल जाला, आ फिर शरीर में Cer के एकाग्रता से भाग दिहल जाला। उहे रंग नक्शा पैमाना के इस्तेमाल कइल जाला।
एह लेख खातिर पूरक सामग्री खातिर, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 देखल जाय
ई एगो खुला पहुँच वाला लेख हवे जे क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-व्यावसायिक लाइसेंस के शर्त के तहत बितरित कइल गइल बाटे, जवना में कौनों भी माध्यम में इस्तेमाल, बितरण आ रिप्रोडक्शन के इजाजत बाटे, जबले कि अंतिम इस्तेमाल ब्यापारिक फायदा खातिर ना होखे आ आधार ई होखे कि मूल रचना सही होखे। सिफारिश।
नोट: हमनी के रउआँ से खाली आपन ईमेल पता देवे के कहत बानी जा ताकि जवना आदमी के रउआँ पन्ना पर सिफारिश कइले बानी ऊ जान जाव कि रउआँ चाहत बानी कि ऊ ईमेल देखे आ ई स्पैम ना ह। हमनी के कवनो ईमेल पता के कैप्चर ना करब जा।
एह सवाल के इस्तेमाल एह बात के परीक्षण करे खातिर कइल जाला कि रउरा विजिटर हईं कि ना आ स्वचालित स्पैम सबमिशन रोके खातिर.
सोफिया रोड्रिग्ज-गैलार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना सबिडो-बोजो, अलेक्जेंडर कोर्टेज · गोमेज (अलेक्जेंडर कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेडा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), ऑक्सीलियाडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकीरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नकानो, मैनुअल मुनिज के नाम बा
3D हाई-रिजोल्यूशन रियल-टाइम इमेजिंग से चयनात्मक आउटपुट साइट में प्रोटीन सॉर्टिंग खातिर सेरामाइड चेन लंबाई के महत्व के पता चलेला।
सोफिया रोड्रिग्ज-गैलार्डो, काजुओ कुरोकावा, सुसाना सबिडो-बोजो, अलेक्जेंडर कोर्टेज · गोमेज (अलेक्जेंडर कोर्टेस-गोमेज), अत्सुको इकेदा (अत्सुको इकेडा), वैलेरिया ज़ोनी (वैलेरिया ज़ोनी), ऑक्सीलियाडोरा एगुइलेरा-रोमेरो, एना मारिया पेरेज -लिनेरो), सर्जियो लोपेज (सर्जियो लोपेज), मिहो वागा (मिहो वागा), मिसाको अरमान (मिसाको अरमान), मियाको रिमन (मियाको रिमन), प्रो अकीरा, स्टीफनो फैनी, अकिहिको नकानो, मैनुअल मुनिज के नाम बा
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