इम्यूनोमोड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स ट्यूमर माइक्रोइंवायरमेंट (TME) के एगो प्रमुख बिसेसता हवें, बाकी कुछ अपवाद सभ के छोड़ के, इनहन के पहिचान बहुत हद तक अज्ञात बा। इहाँ हमनी के हाई ग्रेड सीरस कार्सिनोमा (एचजीएससी) के मरीज के ट्यूमर अवुरी जलन से ट्यूमर अवुरी टी सेल के विश्लेषण कईनी, ताकि ए अलग-अलग टीएमई डिब्बा के मेटाबोलोम के पता चल सके। जलन आ ट्यूमर कोशिका सभ में मेटाबोलाइट में बहुत अंतर होला। जलन के तुलना में ट्यूमर में घुसपैठ करे वाली टी कोशिका सभ में 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) काफी समृद्ध होलीं। हालाँकि, टी कोशिका सभ में एमएनए के स्तर बढ़ जाला, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़ (एगो एंजाइम जे एस-एडेनोसाइलमेथियोनिन से निकोटिनामाइड में मिथाइल समूह सभ के स्थानांतरण के उत्प्रेरक होला) के एक्सप्रेशन फाइब्रोब्लास्ट आ ट्यूमर कोशिका सभ ले सीमित होला। कामकाजी रूप से एमएनए टी कोशिका सभ के ट्यूमर के बढ़ावा देवे वाला साइटोकिन ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर अल्फा के स्राव करे खातिर प्रेरित करे ला। एह से, टीएमई से निकलल एमएनए टी कोशिका सभ के प्रतिरक्षा नियमन में योगदान देला आ मानव कैंसर के इलाज खातिर संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य के प्रतिनिधित्व करे ला।
ट्यूमर से निकलल मेटाबोलाइट्स एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा पर गहिराह निरोधात्मक प्रभाव डाल सके लें आ अधिका से अधिका सबूत बतावे लें कि ई बेमारी के बढ़ती खातिर एगो प्रमुख प्रेरणा शक्ति के रूप में भी काम क सके लें (1)। वारबर्ग प्रभाव के अलावा, हाल के काम शुरू भइल बा कि ट्यूमर कोशिका सभ के मेटाबोलिक स्थिति आ ट्यूमर माइक्रोइंवायरमेंट (TME) के प्रतिरक्षा स्थिति (TME) के साथ एकर संबंध के बिसेसता बतावल गइल बा। माउस मॉडल आ मानव टी कोशिका सभ पर भइल अध्ययन से पता चलल बा कि ग्लूटामाइन मेटाबोलिज्म (2), ऑक्सीडेटिव मेटाबोलिज्म (3) आ ग्लूकोज मेटाबोलिज्म (4) बिबिध प्रतिरक्षा कोशिका उपसमूह सभ पर स्वतंत्र रूप से काम क सके ला। एह रास्ता सभ में कई गो मेटाबोलाइट्स टी कोशिका सभ के एंटी-ट्यूमर कामकाज के रोके लें। ई साबित भइल बा कि कोएंजाइम टेट्राहाइड्रोबायोप्टेरिन (BH4) के नाकाबंदी से टी कोशिका सभ के प्रसार के नुकसान पहुँच सके ला आ शरीर में BH4 के बढ़ती से सीडी 4 आ सीडी 8 के माध्यम से एंटी-ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ सके ला। एकरा अलावे, बीएच 4 ( 5 ) के प्रशासन से किनुरेनिन के इम्यूनोसप्रेसिव प्रभाव के बचावल जा सकता। आइसोसाइट्रेट डिहाइड्रोजनेज (IDH) उत्परिवर्तित ग्लियोब्लास्टोमा में, एनान्टीओमेटाबोलिक (R)-2-हाइड्रोक्सीग्लूटारेट (R-2-HG) के स्राव टी सेल सक्रियण, प्रसार आ साइटोलाइसिस गतिविधि (6) के रोके ला। हाल में ई बतावल गइल बा कि ग्लाइकोलाइसिस के उप-उत्पाद मिथाइलग्लाइओक्सल माइलोइड मूल के सप्रेसर कोशिका सभ द्वारा पैदा होला आ मिथाइलग्लाइओक्सल के टी सेल ट्रांसफर इफेक्टर टी सेल के कामकाज में बाधा डाल सके ला। इलाज में, मिथाइलग्लाइओक्सल के बेअसर कइल माइलोइड-व्युत्पन्न सप्रेसर कोशिका (MDSC) के गतिविधि पर काबू पा सके ला आ माउस मॉडल में चेकपॉइंट नाकाबंदी थेरापी के समन्वयात्मक रूप से बढ़ा सके ला ( 7 )। ई अध्ययन सामूहिक रूप से टी सेल के कामकाज आ गतिविधि के नियंत्रित करे में टीएमई से निकलल मेटाबोलाइट्स के प्रमुख भूमिका पर जोर देलें।
अंडाशय के कैंसर में टी सेल के बिकार के व्यापक रूप से रिपोर्ट कइल गइल बा ( 8 )। एकर कुछ हद तक कारण हाइपोक्सिया आ असामान्य ट्यूमर संवहनी में निहित मेटाबोलिक बिसेसता (9) होला, जेकरा परिणामस्वरूप ग्लूकोज आ ट्रिप्टोफैन के लैक्टिक एसिड आ किनुरेनिन नियर उप-उत्पाद में बदल जाला। अत्यधिक बाह्य कोशिका लैक्टेट इंटरफेरोन-γ (IFN-γ) के उत्पादन के कम करे ला आ माइलोसप्रेसिव उपसमूह सभ के बिभेद के चलावे ला ( 10 , 11 )। ट्रिप्टोफैन के सेवन से सीधे टी सेल के प्रसार में बाधा आवेला आ टी सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग में बाधा आवेला ( 12-14 )। एह निरीक्षण सभ के बावजूद, प्रतिरक्षा चयापचय के आसपास बहुत काम इन विट्रो टी सेल कल्चर में अनुकूलित मीडिया के इस्तेमाल से कइल गइल, या फिर इन विवो में होमोलॉगस माउस मॉडल तक ले सीमित कइल गइल, दुनों में से कौनों भी मानव कैंसर आ फिजियोलॉजिकल मैक्रो आ माइक्रो वातावरण के बिसमरूपता के पूरा तरीका से ना देखावे ला।
अंडाशय के कैंसर के एगो आम बिसेसता पेरिटोनियल फइलल आ जलन के लउके के होला। जलन में कोशिका तरल पदार्थ के जमाव उन्नत बेमारी आ खराब पूर्वानुमान से जुड़ल होला ( 15 )। रिपोर्ट सभ के मोताबिक ई बिसेस डिब्बा हाइपोक्सिक होला, संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) आ इंडोलियमाइन 2,3-डाइऑक्सीजनेज (IDO) के मात्रा ढेर होला आ टी रेगुलेटरी सेल आ माइलोइड इनहिबिटरी सेल सभ के घुसपैठ होला (15-18)। जलन के मेटाबोलिक वातावरण खुद ट्यूमर से अलग हो सके ला, एह से पेरिटोनियल स्पेस में टी कोशिका सभ के रिप्रोग्रामिंग साफ ना होला। एकरे अलावा, ट्यूमर के वातावरण में मौजूद जलन आ मेटाबोलाइट्स के बीच के प्रमुख अंतर आ बिसमरूपता प्रतिरक्षा कोशिका सभ के घुसपैठ आ ट्यूमर पर इनहन के कामकाज में बाधा डाल सके ला आ अउरी रिसर्च के जरूरत बा।
एह समस्या के हल करे खातिर हमनी के एगो संवेदनशील कोशिका अलगाव आ तरल क्रोमैटोग्राफी टैंडम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस/एमएस) तरीका के डिजाइन कइनी जा जेह में अलग-अलग कोशिका प्रकार (सीडी 4 + आ सीडी 8 + टी कोशिका सहित) के अध्ययन करे के साथे-साथ ट्यूमर के भीतर आ बीच के अध्ययन कइल जा सके ला एकर मेटाबोलाइट्स रोगी के एकही जलन आ ट्यूमर वातावरण में कोशिका सभ के फैलल बा। हमनी के एह तरीका के इस्तेमाल हाई-डायमेंशनल फ्लो साइटोमेट्री आ सिंगल-सेल आरएनए सीक्वेंसिंग (scRNA-seq) के संयोजन में करे लीं ताकि एह प्रमुख आबादी सभ के मेटाबोलिक स्टेटस के हाई रिजोल्यूशन चित्र उपलब्ध करावल जा सके। एह तरीका से ट्यूमर टी कोशिका सभ में 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड (MNA) के स्तर में काफी बढ़ती के पता चलल आ इन विट्रो प्रयोग सभ से पता चलल कि टी कोशिका सभ के कामकाज पर एमएनए के इम्यूनोमोड्यूलेटरी प्रभाव के बारे में पहिले जानकारी ना रहे। आमतौर पर, ई तरीका ट्यूमर आ प्रतिरक्षा कोशिका सभ के बीच आपसी चयापचय के परस्पर क्रिया सभ के खुलासा करे ला, आ प्रतिरक्षा नियमन मेटाबोलाइट्स के बारे में बिसेस जानकारी देला, जवन टी कोशिका आधारित अंडाशय के कैंसर के इलाज खातिर उपयोगी हो सके ला इम्यूनोथेरेपी इलाज के अवसर।
हमनी के एक साथ ग्लूकोज अवशोषण के मात्रा निर्धारित करे खातिर उच्च आयामी प्रवाह साइटोमेट्री के इस्तेमाल कइनी जा [2- (एन- (7-नाइट्रोफिनाइल-2-ऑक्सा-1,3-डायजा-4-इल) एमिनो) -2-डिऑक्सीग्लूकोज (2-एनबीडीजी) आ माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि [माइटोट्रैकर डीप रेड (एमटी डीआर)] (7, 19, 20) एक दूसरा के बगल में ठेठ बा मार्कर जे प्रतिरक्षा कोशिका आ ट्यूमर कोशिका के आबादी में अंतर करे लें (तालिका S2 आ चित्र S1A)। एह विश्लेषण से पता चलल कि टी कोशिका के मुक़ाबले जलन अवुरी ट्यूमर कोशिका में ग्लूकोज के लेवे के स्तर जादा होखेला, लेकिन माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि में छोट अंतर होखेला। ट्यूमर कोशिका सभ के औसत ग्लूकोज अपटेक [CD45-EpCAM (EpCAM)+] टी कोशिका सभ के तुलना में तीन से चार गुना होला आ सीडी 4 + टी कोशिका सभ के औसत ग्लूकोज अपटेक सीडी 8 + टी कोशिका सभ के 1.2 गुना होला, ई बतावे ला कि ट्यूमर घुसपैठ करे वाला लिम्फोसाइट्स (TIL) सभ के एकही TME में भी अलग-अलग मेटाबोलिक जरूरत होला (चित्र 1A)। एकरे बिपरीत, ट्यूमर कोशिका सभ में माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिका सभ के नियर होला आ दुनों प्रकार के कोशिका सभ के माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिका सभ के तुलना में ढेर होला (चित्र 1 बी)। सामान्य तौर प इ नतीजा मेटाबोलिक लेवल के पता लगावेला। ट्यूमर कोशिका सभ के मेटाबोलिक एक्टिविटी सीडी 4 + टी कोशिका सभ के तुलना में ढेर होला आ सीडी 4 + टी कोशिका सभ के मेटाबोलिक एक्टिविटी सीडी 8 + टी कोशिका सभ के तुलना में ढेर होला। कोशिका प्रकार सभ में एह परभाव सभ के बावजूद, ट्यूमर के तुलना में जलन में सीडी 4 + आ सीडी 8 + टी कोशिका सभ के मेटाबोलिक स्थिति भा इनहन के सापेक्षिक अनुपात में लगातार अंतर ना लउके ला (चित्र 1C)। एकरा विपरीत, सीडी 45-कोशिका अंश में, ट्यूमर में EpCAM + कोशिका के अनुपात जलन के तुलना में बढ़ गईल (चित्र 1 डी)। हमनी के EpCAM + अवुरी EpCAM- कोशिका घटक के बीच एगो स्पष्ट चयापचय अंतर भी देखनी। EpCAM+ (ट्यूमर) कोशिका सभ में EpCAM- कोशिका सभ के तुलना में ग्लूकोज के लेवे आ माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि ढेर होला, जवन TME में ट्यूमर कोशिका सभ में फाइब्रोब्लास्ट सभ के मेटाबोलिक गतिविधि से बहुत ढेर होला (चित्र 1, ई आ एफ)।
(ए आ बी) ग्लूकोज अपटेक (2-एनबीडीजी) (ए) आ सीडी 4 + टी कोशिका (माइटोट्रैकर डार्क रेड) के माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि के मीडियन फ्लोरोसेंस तीव्रता (एमएफआई) (बी) प्रतिनिधि ग्राफ (बाँए) आ सारणीबद्ध डेटा (दाहिना), सीडी 8 + टी कोशिका आ जलन आ ट्यूमर से ईपीसीएएम + सीडी 45-ट्यूमर कोशिका। (C) जलन आ ट्यूमर में सीडी 4 + आ सीडी 8 + कोशिका (सीडी 3 + टी कोशिका के) के अनुपात। (D) जलन आ ट्यूमर (CD45−) में EpCAM + ट्यूमर कोशिका के अनुपात। (ई आ एफ) EpCAM + CD45-ट्यूमर आ EpCAM-CD45-मैट्रिक्स ग्लूकोज अपटेक (2-NBDG) (ई) आ माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि (MitoTracker डार्क रेड) (F) प्रतिनिधि ग्राफ (बाँए) आ सारणीबद्ध डेटा ( दाहिना) जलन आ ट्यूमर कोशिका। (जी) फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी 25, सीडी 137 और पीडी 1 अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि ग्राफ। (एच आ आई) सीडी 4 + टी कोशिका (एच) आ सीडी 8 + टी कोशिका (आई) पर सीडी 25, सीडी 137 आ पीडी 1 अभिव्यक्ति। (जे आ के) CCR7 आ CD45RO के अभिव्यक्ति पर आधारित भोला, केंद्रीय स्मृति (Tcm), प्रभावक (Teff) आ प्रभावक स्मृति (Tem) फेनोटाइप। जलन आ ट्यूमर में सीडी 4 + टी कोशिका (जे) आ सीडी 8 + टी कोशिका (के) के प्रतिनिधि छवि (बाँए) आ सारणीबद्ध डेटा (दाएं)। जोड़ीदार टी-परीक्षण (* पी <0.05, ** पी <0.01 और *** पी <0.001) द्वारा निर्धारित पी मान। लाइन मिलान मरीज (n = 6) के प्रतिनिधित्व करेले। एफएमओ, प्रतिदीप्ति माइनस एक के बा; एमएफआई, माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता के बा।
आगे के विश्लेषण से बहुत रिजोल्यूशन टी सेल फेनोटाइपिक स्टेटस के बीच अवुरी महत्वपूर्ण अंतर के पता चलल। ट्यूमर में सक्रिय (चित्र 1, जी से आई) अवुरी इफेक्टर मेमोरी (चित्र 1, जे अवुरी के) जलन (सीडी 3 + टी कोशिका के अनुपात) के मुक़ाबले बहुत जादे होखेला। एही तरे सक्रियण मार्कर (CD25 आ CD137) आ डिप्लीशन मार्कर [प्रोग्राम कइल सेल डेथ प्रोटीन 1 (PD1)] के अभिव्यक्ति से फेनोटाइप के बिस्लेषण से पता चलल कि हालाँकि, एह आबादी सभ के मेटाबोलिक बिसेसता अलग-अलग होले (चित्र S1, B से E) , बाकी भोला-भाला, इफेक्टर भा मेमोरी सबसेट सभ के बीच लगातार कौनों खास मेटाबोलिक अंतर ना देखल गइल (चित्र S1, F से I)। एह परिणामन के पुष्टि मशीन लर्निंग विधि के इस्तेमाल से कोशिका फेनोटाइप (21) के स्वचालित रूप से असाइन करे से कइल गइल, जवना से आगे मरीज के जलन में अस्थि मज्जा कोशिका (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) के बहुत संख्या के मौजूदगी के पता चलल (चित्र S2A)। सभ चिन्हित कोशिका प्रकार सभ में, ई माइलोइड कोशिका आबादी सभसे ढेर ग्लूकोज के अवशोषण आ माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि देखवलस (चित्र S2, B से G)। ई नतीजा एचजीएससी के मरीजन में जलन आ ट्यूमर में पावल जाए वाला कई गो कोशिका प्रकार सभ के बीच मजबूत मेटाबोलिक अंतर के रेखांकित करे ला।
टीआईएल के मेटाबोनोमिक विशेषता के समझे में मुख्य चुनौती ट्यूमर से पर्याप्त शुद्धता, गुणवत्ता आ मात्रा के टी सेल नमूना के अलग करे के जरूरत बा। हाल के अध्ययन सभ से पता चलल बा कि फ्लो साइटोमेट्री पर आधारित छँटाई आ बीड संवर्धन के तरीका से सेलुलर मेटाबोलाइट प्रोफाइल में बदलाव हो सके ला ( 22-24 )। एह समस्या से उबर के हमनी के एलसी-एमएस / एमएस (देखीं सामग्री आ विधि; चित्र 2 ए) द्वारा विश्लेषण से पहिले सर्जिकल रूप से रिसेक्ट कइल मानव अंडाशय कैंसर से टीआईएल के अलग करे आ अलग करे खातिर मनका संवर्धन विधि के अनुकूलित कइनी जा। मेटाबोलाइट परिवर्तन पर एह प्रोटोकॉल के समग्र प्रभाव के आकलन करे खातिर हमनी के उपरोक्त बीड अलग करे के कदम के बाद स्वस्थ दाता लोग द्वारा सक्रिय टी कोशिका के मेटाबोलाइट प्रोफाइल के तुलना ओह कोशिका से कइनी जा जवन बीड से अलग ना रहे लेकिन बर्फ पर रहे। एह क्वालिटी कंट्रोल एनालिसिस में पावल गइल कि एह दुनों स्थिति सभ के बीच बहुत सहसंबंध बा (r = 0.77), आ 86 मेटाबोलाइट्स के समूह के तकनीकी रिपीटेबिलिटी में रिपीटेबिलिटी बहुत बा (चित्र 2 बी)। एह से ई तरीका सभ कोशिका प्रकार के संवर्धन से गुजरे वाली कोशिका सभ में सही मेटाबोलाइट बिस्लेषण क सके लें, एह तरीका से एचजीएससी में बिसेस मेटाबोलाइट्स के पहिचान करे खातिर पहिला हाई-रिजोल्यूशन प्लेटफार्म उपलब्ध करावल जा सके ला, जेकरा से लोग कोशिका बिसेसता के गहिराह समझ हासिल करे में सक्षम हो सके ला सेक्सुअल मेटाबोलिज्म प्रोग्राम।
(ए) चुंबकीय मनका संवर्धन के योजनाबद्ध आरेख। एलसी-एमएस/एमएस द्वारा विश्लेषण से पहिले कोशिका सभ के लगातार तीन दौर के चुंबकीय बीड संवर्धन होखी भा बर्फ पर रह जाई। (ख) मेटाबोलाइट्स के प्रचुरता पर संवर्धन प्रकार के प्रभाव। हर संवर्धन प्रकार ± एसई के लिए तीन माप के औसत। ग्रे रेखा 1:1 के रिश्ता के प्रतिनिधित्व करेले। अक्ष लेबल में देखावल गइल बार-बार माप के इंट्रा-क्लास सहसंबंध (ICC)। एनएडी, निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लिओटाइड के नाम से जानल जाला। (C) रोगी मेटाबोलाइट विश्लेषण के कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध आरेख। जलोढ़ भा ट्यूमर के मरीज से एकट्ठा क के क्रायोप्रिजर्व कइल जाला। हर नमूना के एगो छोट हिस्सा के फ्लो साइटोमेट्री से विश्लेषण कइल गइल जबकि बाकी नमूना सभ के सीडी 4+, सीडी 8+ आ सीडी 45- कोशिका सभ खातिर तीन दौर के संवर्धन कइल गइल। एह कोशिका अंश के विश्लेषण एलसी-एमएस/एमएस के उपयोग से कइल गइल। (D) मानकीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरता के हीट मैप। डेंड्रोग्राम नमूना सभ के बीच यूक्लिडियन दूरी सभ के वार्ड के समूहीकरण के प्रतिनिधित्व करे ला। (ई) नमूना मेटाबोलाइट नक्शा के प्रधान घटक विश्लेषण (पीसीए), हर नमूना के तीन प्रतिकृति देखावत, एकही रोगी के नमूना के एगो लाइन से जोड़ल जाला। (F) रोगी पर कंडीशन कइल नमूना के मेटाबोलाइट प्रोफाइल के पीसीए (यानी, आंशिक रिडंडेंसी के इस्तेमाल से); नमूना के प्रकार उत्तल पतवार के कारण सीमित होला। पीसी1, मुख्य घटक 1 के बा; पीसी2, मुख्य घटक 2 के बा।
एकरा बाद, हमनी के छह एचजीएससी मरीज के प्राथमिक जलन अवुरी ट्यूमर में सीडी 4 +, सीडी 8 + अवुरी सीडी 45-सेल अंश में 99 मेटाबोलाइट्स के विश्लेषण करे खाती ए संवर्धन विधि के लागू कईनी (चित्र 2 सी, चित्र एस 3 ए अवुरी तालिका एस 3 अवुरी एस 4)। ब्याज के आबादी जीवित कोशिका सभ के मूल बड़हन नमूना के 2% से 70% होला आ कोशिका सभ के अनुपात में मरीजन के बीच बहुत अंतर होला। बीड्स के अलग कइला के बाद, ब्याज के समृद्ध अंश (CD4+, CD8+ या CD45-) औसतन नमूना में मौजूद सगरी जीवित कोशिका सभ के 85% से ढेर हिस्सा होला। एह संवर्धन तरीका से हमनी के मानव ट्यूमर ऊतक चयापचय से कोशिका के आबादी के विश्लेषण कर सकेनी जा, जवन कि बड़हन नमूना से कइल असंभव बा। एह प्रोटोकॉल के इस्तेमाल से हमनी के ई तय कइनी जा कि एल-काइनुरेनिन आ एडेनोसाइने, ई दुनों बढ़िया से विशेषता वाला इम्यूनोसप्रेसिव मेटाबोलाइट्स ट्यूमर टी कोशिका भा ट्यूमर कोशिका में बढ़ गइल बाड़ें (चित्र S3, बी आ सी)। एहसे ई परिणाम हमनी के कोशिका अलगाव आ मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक के निष्ठा आ क्षमता के देखावत बा जवना से मरीज के ऊतकन में जैविक रूप से महत्वपूर्ण मेटाबोलाइट्स खोजल जा सके.
हमनी के विश्लेषण में मरीज के भीतर अवुरी बीच कोशिका प्रकार के मजबूत चयापचय अलगाव के भी पता चलल (चित्र 2 डी अवुरी चित्र S4A)। खासतौर पर, अन्य मरीजन के तुलना में, मरीज 70 में अलग-अलग मेटाबोलिक बिसेसता देखल गइल (चित्र 2E आ चित्र S4B), ई बतावे ला कि मरीजन के बीच काफी मेटाबोलिक बिसमरूपता हो सके ला। ध्यान देवे वाला बात बा कि बाकी मरीज (1.2 से 2 लीटर; तालिका S1) के मुक़ाबले, मरीज 70 (80 मिलीलीटर) में एकट्ठा भईल जलन के कुल मात्रा कम रहे। प्रिंसिपल कंपोनेंट एनालिसिस के दौरान इंटर-रोगी विषमता के नियंत्रण (उदाहरण खातिर, आंशिक रिडंडेंसी एनालिसिस के इस्तेमाल से) कोशिका प्रकार सभ के बीच लगातार बदलाव देखावे ला, आ कोशिका के प्रकार आ/या माइक्रोइंवायरमेंट सभ के मेटाबोलाइट प्रोफाइल के अनुसार साफ-साफ एकट्ठा कइल जाला (चित्र 2F)। एकल मेटाबोलाइट्स के बिस्लेषण में एह परभाव सभ पर जोर दिहल गइल आ कोशिका के प्रकार आ सूक्ष्म वातावरण के बीच काफी अंतर के पता चलल। इहाँ ई बतावल जरूरी बा कि सभसे चरम अंतर देखल जाला एमएनए में, जवन आमतौर पर सीडी45- कोशिका सभ में आ ट्यूमर में घुसपैठ करे वाली सीडी4+ आ सीडी8+ कोशिका सभ में समृद्ध होला (चित्र 3A)। सीडी 4 + कोशिका सभ खातिर ई परभाव सभसे ढेर लउके ला आ सीडी 8 + कोशिका सभ में मौजूद एमएनए पर भी पर्यावरण से बहुत परभाव पड़े वाला लउके ला। हालांकि, इ महत्वपूर्ण नईखे, काहेंकी 6 मरीज में से सिर्फ तीन मरीज के ट्यूमर सीडी 8+ स्कोर खाती मूल्यांकन कईल जा सकता। एमएनए के अलावा, जलन आ ट्यूमर में अलग-अलग किसिम के कोशिका सभ में, अन्य मेटाबोलाइट्स जे टीआईएल में खराब बिसेसता वाला होखे लें, भी अंतर से समृद्ध होलें (चित्र S3 आ S4)। एह से ई डेटा आगे के रिसर्च खातिर इम्यूनोमोड्यूलेटरी मेटाबोलाइट्स के एगो होनहार सेट के उजागर करे ला।
(ए) जलन आ ट्यूमर से सीडी 4 +, सीडी 8 + आ सीडी 45- कोशिका में एमएनए के सामान्य सामग्री। बॉक्स प्लॉट में मीडियन (लाइन), इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम काज) आ डेटा रेंज देखावल गइल बा, ई इंटरक्वार्टाइल रेंज (फ्रेम व्हिस्कर) के 1.5 गुना तक ले। जइसन कि रोगी सामग्री आ तरीका में बतावल गइल बा, पी मान (* पी <0.05 आ ** पी <0.01) के निर्धारण करे खातिर रोगी के लिमा मान के इस्तेमाल करीं। (बी) एमएनए चयापचय के योजनाबद्ध आरेख (60)। मेटाबोलाइट्स: एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन; एसएएच, एस-एडेनोसिन-1-होमोसिस्टीन के बा; एनए, निकोटिनामाइड के नाम से जानल जाला; एमएनए, 1-मिथाइलनिकोटिनामाइड के बा; 2-पीवाई, 1-मिथाइल- 2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड के बा; 4-पीवाई, 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड के बा; एनआर, निकोटिनामाइड राइबोज के बा; एनएमएन, निकोटिनामाइड मोनोन्यूक्लिओटाइड के नाम से जानल जाला। एंजाइम (हरा): एनएनएमटी, निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़; SIRT, सिर्टुइन के नाम से जानल जाला; एनएएमपीटी, निकोटिनामाइड फॉस्फोरिबोसाइल ट्रांसफरेज़; एओएक्स1, एल्डीहाइड ऑक्सीडेज 1 के बा; एनआरके, निकोटिनामाइड राइबोसाइड किनेज के नाम से जानल जाला; एनएमएनएटी, निकोटिनामाइड मोनो न्यूक्लियोटाइड एडेनिलेट ट्रांसफरेज़; Pnp1, प्यूरीन न्यूक्लियोसाइड फॉस्फोरिलेज के नाम से जानल जाला। (सी) जलन (ग्रे) आ ट्यूमर (लाल; एन = 3 मरीज) के scRNA-seq के टी-एसएनई। (डी) scRNA-seq के उपयोग से पहचानल गइल अलग-अलग कोशिका आबादी में एनएनएमटी अभिव्यक्ति। (ई) एसके-ओवी-3, मानव भ्रूण गुर्दा (एचईके) 293टी, टी कोशिका आ एमएनए से उपचारित टी कोशिका में एनएनएमटी आ एओएक्स1 के अभिव्यक्ति। तह अभिव्यक्ति के एसके-ओवी-3 के सापेक्ष देखावल गइल बा। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावल गइल बा (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 से अधिका Ct मान के अज्ञात (UD) मानल जाला। (एफ) 8mM एमएनए के साथ उपचारित एसके-ओवी-3, एचईके293टी, टी कोशिकाओं और टी कोशिकाओं में SLC22A1 और SLC22A2 की अभिव्यक्ति। तह अभिव्यक्ति के एसके-ओवी-3 के सापेक्ष देखावल गइल बा। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावल गइल बा (n = 6 स्वस्थ दाता)। 35 से अधिका Ct मान के अज्ञात (UD) मानल जाला। (जी) एमएनए के साथ ऊष्मायन के 72 घंटे के बाद सक्रिय स्वस्थ दाता टी कोशिकाओं में कोशिका एमएनए सामग्री। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावल गइल बा (n = 4 स्वस्थ दाता)।
एमएनए के निर्माण मिथाइल समूह के एस-एडेनोसाइल-1-मेथियोनिन (SAM) से निकोटिनामाइड (NA) में निकोटिनामाइड एन-मिथाइलट्रांसफरेज़ (NNMT; चित्र 3B) द्वारा स्थानांतरित करके कइल जाला। एनएनएमटी कई किसिम के मानव कैंसर सभ में ओवरएक्सप्रेस होला आ ई प्रसार, आक्रमण आ मेटास्टेसिस से जुड़ल होला (25-27)। टीएमई में टी कोशिका में एमएनए के स्रोत के बेहतर तरीका से समझे खातिर, हमनी के तीन एचजीएससी मरीज के जलन अवुरी ट्यूमर में कोशिका प्रकार के पार एनएनएमटी के अभिव्यक्ति के विशेषता बतावे खाती scRNA-seq के इस्तेमाल कईनी (तालिका S5)। लगभग 6,500 कोशिका सभ के बिस्लेषण से पता चलल कि जलन आ ट्यूमर के माहौल में, एनएनएमटी एक्सप्रेशन अनुमानित फाइब्रोब्लास्ट आ ट्यूमर कोशिका आबादी तक ले सीमित रहे (चित्र 3, सी आ डी)। इहाँ ई बतावल जाय कि कौनों भी आबादी में एनएनएमटी एक्सप्रेशन के कौनों स्पष्ट अभिव्यक्ति ना होला जे पीटीपीआरसी (CD45 +) के एक्सप्रेस करे (चित्र 3D आ चित्र S5A), ई बतावे ला कि मेटाबोलाइट स्पेक्ट्रम में पावल गइल एमएनए के टी कोशिका सभ में प्रवेश कइल गइल बा। एल्डीहाइड ऑक्सीडेज 1 (AOX1) के एक्सप्रेशन एमएनए के 1-मिथाइल-2-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (2-PYR) या 1-मिथाइल-4-पाइरिडोन-5-कार्बोक्सामाइड (4- PYR) में बदल देले; चित्र 3B) COL1A1 (चित्र S5A) के एक्सप्रेस करे वाला फाइब्रोब्लास्ट सभ के आबादी तक ले भी सीमित बा, जवन मिल के ई बतावे ला कि टी कोशिका सभ में परंपरागत एमएनए चयापचय के क्षमता के कमी होला। एह एमएनए से संबंधित जीन के अभिव्यक्ति पैटर्न के सत्यापन एचजीएससी मरीजन से जलन से दूसरा स्वतंत्र कोशिका डेटा सेट के उपयोग से कइल गइल (चित्र S5B; n = 6) (16)। एकरे अलावा, एमएनए से इलाज कइल गइल स्वस्थ दाता टी कोशिका सभ के मात्रात्मक पॉलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) विश्लेषण से पता चलल कि नियंत्रण एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिका सभ के तुलना में, एनएनएमटी या एओएक्स1 लगभग व्यक्त ना भइल (चित्र 3 ई)। ई अप्रत्याशित परिणाम बतावे लें कि एमएनए फाइब्रोब्लास्ट भा ट्यूमर से टीएमई में बगल के टी कोशिका सभ में स्रावित हो सके ला।
हालांकि उम्मीदवार में घुलनशील वाहक 22 (SLC22) परिवार (SLC22A1, SLC22A2 आ SLC22A3) द्वारा एन्कोड कइल गइल कार्बनिक कैटियन ट्रांसपोर्टर 1 से 3 (OCT1, OCT2 आ OCT3) के परिवार शामिल बा, एमएनए के संभावित ट्रांसपोर्टर अबहिन ले अपरिभाषित बाड़ें (28)। स्वस्थ दाता टी कोशिका से mRNA के QPCR SLC22A1 के कम अभिव्यक्ति स्तर लेकिन SLC22A2 के अज्ञात स्तर देखवलस, जवन पुष्टि कईलस कि एकरा के पहिले साहित्य में रिपोर्ट कईल गईल रहे (चित्र 3F) (29)। एकरा विपरीत, एसके-ओवी-3 अंडाशय ट्यूमर सेल लाइन दुनो ट्रांसपोर्टर के उच्च स्तर के अभिव्यक्ति कईलस (चित्र 3 एफ)।
टी कोशिका सभ में विदेशी एमएनए के सोख लेवे के क्षमता होखे के संभावना के परीक्षण करे खातिर, स्वस्थ दाता टी कोशिका सभ के एमएनए के अलग-अलग एकाग्रता के मौजूदगी में 72 घंटा ले संवर्धित कइल गइल। बहिर्जात एमएनए के अभाव में एमएनए के कोशिका सामग्री के पता ना लगावल जा सकेला (चित्र 3 जी)। हालांकि, बहिर्जात एमएनए से इलाज कइल गइल सक्रिय टी कोशिका सभ में कोशिका सभ में एमएनए सामग्री में खुराक पर निर्भर बढ़ती देखल गइल, 6 एमएम एमएनए तक (चित्र 3 जी)। ई परिणाम बतावे ला कि ट्रांसपोर्टर एक्सप्रेशन के कम स्तर आ इंट्रासेलुलर एमएनए मेटाबोलिज्म खातिर जिम्मेदार मुख्य एंजाइम के कमी के बावजूद, टीआईएल अबहिन ले एमएनए के ले सके ला।
मरीजन के टी कोशिका सभ में मेटाबोलाइट्स के स्पेक्ट्रम आ इन विट्रो एमएनए सोख के प्रयोग से ई संभावना बढ़ जाला कि कैंसर से जुड़ल फाइब्रोब्लास्ट (CAF) एमएनए के स्राव करे लें आ ट्यूमर कोशिका सभ टीआईएल के फेनोटाइप आ कामकाज के नियंत्रित क सके लीं। टी कोशिका सभ पर एमएनए के परभाव के निर्धारण करे खातिर, स्वस्थ दाता टी कोशिका सभ के एमएनए के मौजूदगी भा अनुपस्थिति में इन विट्रो में सक्रिय कइल गइल आ इनहन के प्रसार आ साइटोकिन उत्पादन के मूल्यांकन कइल गइल। सबसे अधिक खुराक में एमएनए जोड़ला के 7 दिन के बाद, जनसंख्या दुगुना संख्या में मध्यम कमी आईल, जबकि सभ खुराक में जोश बनल रहे (चित्र 4 ए)। एकरे अलावा, बहिर्जात एमएनए के इलाज के परिणामस्वरूप ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर-α (TNFα; चित्र 4 बी) के एक्सप्रेस करे वाली सीडी 4 + आ सीडी 8 + टी कोशिका सभ के अनुपात में बढ़ती भइल। एकरे बिपरीत, सीडी 4 + टी कोशिका सभ में IFN-γ के इंट्रासेलुलर उत्पादन में काफी कमी आइल, बाकी सीडी 8 + टी कोशिका सभ में ना, आ इंटरल्यूकिन 2 (IL-2; चित्र 4, सी आ डी) में कौनों खास बदलाव ना भइल। एह से, एह एमएनए-इलाज टी सेल कल्चर सभ से सुपरनेटेंट सभ के एंजाइम-लिंक इम्यूनोसॉर्बेंट परख (ELISA) में TNFα में काफी बढ़ती, IFN-γ में कमी आ आईएल-2 में कौनों बदलाव ना देखल गइल (चित्र 4, ई से जी)। . IFN-γ में कमी से पता चले ला कि एमएनए टी कोशिका सभ के एंटी-ट्यूमर गतिविधि के रोके में भूमिका निभा सके ला। टी सेल-मध्यस्थ साइटोटोक्सिसिटी पर एमएनए के परभाव के अनुकरण करे खातिर, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) -CAR-T) कोशिका सभ द्वारा नियंत्रित फोलेट रिसेप्टर α आ CAR-T (GFP) के लक्ष्य बनावे वाली काइमेरियल एंटीजन रिसेप्टर टी (FRα-CAR-T) कोशिका सभ के निर्माण स्वस्थ दाता परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिका (PBMC) द्वारा कइल जाला। CAR-T कोशिका सभ के एमएनए के मौजूदगी में 24 घंटा ले संवर्धित कइल गइल, आ फिर मानव SK-OV-3 अंडाशय ट्यूमर कोशिका सभ के साथ सह-संवर्धित कइल गइल जे फोलेट रिसेप्टर α के 10:1 के इफेक्टर आ टारगेट अनुपात पर एक्सप्रेस करे लीं। एमएनए उपचार के परिणामस्वरूप FRα-CAR-T कोशिका के हत्या गतिविधि में काफी कमी आईल, जवन एडेनोसाइने से इलाज कईल गईल FRα-CAR-T कोशिका के समान रहे (चित्र 4 एच)।
(ए) कुल व्यवहार्य कोशिका गिनती आ जनसंख्या दोगुना (पीडी) सीधे दिन 7 पर संस्कृति से बार ग्राफ छह स्वस्थ दाता के औसत + एसईएम के प्रतिनिधित्व करेला। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग से डेटा के प्रतिनिधित्व करेला। (बी से डी) सीडी 3/सीडी28 आ आईएल-2 के इस्तेमाल टी कोशिका के अपना-अपना एमएनए एकाग्रता पर 7 दिन तक सक्रिय करे खातिर कइल गइल। विश्लेषण से पहिले, कोशिका के गोल्गीस्टॉप के साथ पीएमए / आयनोमाइसिन के साथ 4 घंटा तक उत्तेजित कइल गइल। टी कोशिका में TNFα (बी) अभिव्यक्ति के बा। जीवित कोशिका में TNFα अभिव्यक्ति के उदाहरण छवि (बाएं) आ सारणीबद्ध डेटा (दाएं)। टी कोशिका में आईएफएन-γ (सी) आ आईएल-2 (डी) के अभिव्यक्ति। साइटोकाइन्स के अभिव्यक्ति के फ्लो साइटोमेट्री से नापल गइल। बार ग्राफ औसत (n = 6 स्वस्थ दाता) + एसईएम के प्रतिनिधित्व करेला। पी मान के निर्धारण करे खातिर विचरण के एकतरफा विश्लेषण आ दोहरावल माप (* पी <0.05 आ ** पी <0.01) के इस्तेमाल करीं। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग से डेटा के प्रतिनिधित्व करेला। (ई से जी) सीडी 3/सीडी28 आ आईएल-2 के इस्तेमाल टी कोशिका के अपना-अपना एमएनए एकाग्रता पर 7 दिन तक सक्रिय करे खातिर कइल गइल। पीएमए/आयनोमाइसिन उत्तेजना के 4 घंटा से पहिले आ बाद में माध्यम के एकट्ठा कइल गइल। TNFα (E), IFN-γ (F) आ IL-2 (G) के एकाग्रता के एलिसा द्वारा नापल गइल। बार ग्राफ औसत (n = 5 स्वस्थ दाता) + एसईएम के प्रतिनिधित्व करेला। पी मान विचरण के एकतरफा विश्लेषण आ बार-बार माप (* पी <0.05) के उपयोग से निर्धारित कइल गइल। बिंदीदार रेखा पता लगावे के सीमा के इंगित करेले। (एच) कोशिका लाइसिस परख के बा। FRα-CAR-T या GFP-CAR-T कोशिका के एडेनोसाइने (250μM) या MNA (10 mM) के साथ 24 घंटा तक समायोजित कइल गइल, या बिना इलाज के छोड़ दिहल गइल (Ctrl)। एसके-ओवी-3 कोशिका के प्रतिशत हत्या के मापल गईल। वेल्च टी परीक्षण (* पी <0.5 और ** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान।
एमएनए-निर्भर TNFα अभिव्यक्ति नियमन के यंत्रवत समझ हासिल करे खातिर, एमएनए-इलाज टी कोशिका के TNFα mRNA में बदलाव के मूल्यांकन कइल गइल (चित्र 5 ए)। एमएनए से इलाज कइल गइल स्वस्थ दाता टी कोशिका सभ में TNFα ट्रांसक्रिप्शन लेवल में दू गुना बढ़ती देखल गइल, ई बतावे ला कि एमएनए TNFα ट्रांसक्रिप्शनल रेगुलेशन पर निर्भर बा। एह संभावित नियामक तंत्र के जांच करे खातिर, दू गो ज्ञात ट्रांसक्रिप्शन कारक जे TNFα के नियंत्रित करे लें, यानी सक्रिय टी सेल न्यूक्लियर फैक्टर (NFAT) आ बिसेस प्रोटीन 1 (Sp1), के प्रोक्सिमल TNFα प्रोमोटर ( 30 ) के एमएनए बाइंडिंग के जवाब में मूल्यांकन कइल गइल। TNFα प्रोमोटर में 6 गो चिन्हित NFAT बाइंडिंग साइट आ 2 Sp1 बाइंडिंग साइट होलें, एक साइट पर ओवरलैप होलें [5'cap से -55 बेस जोड़ी (bp)] (30)। क्रोमैटिन इम्यूनोप्रेसिपिटेशन (ChIP) से पता चलल कि जब MNA से इलाज कइल गइल त Sp1 के TNFα प्रोमोटर से जुड़ाव तीन गुना बढ़ जाला। एनएफएटी के शामिल कइल भी बढ़ल आ महत्व के नजदीक आ गइल (चित्र 5 बी)। ई डेटा बतावे ला कि एमएनए Sp1 ट्रांसक्रिप्शन के माध्यम से TNFα के एक्सप्रेशन के नियंत्रित करे ला, आ कम हद तक NFAT के एक्सप्रेशन के।
(ए) एमएनए के बिना संवर्धित टी कोशिका के साथ तुलना में, एमएनए के साथ इलाज टी कोशिका में TNFα अभिव्यक्ति के गुना बदलाव। एसईएम के साथ अभिव्यक्ति पैटर्न देखावल गइल बा (n = 5 स्वस्थ दाता)। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग से डेटा के प्रतिनिधित्व करेला। (B) NFAT आ Sp1 के बाद 8 mM MNA के साथ या बिना उपचारित टी कोशिका के TNFα प्रोमोटर के (Ctrl) आ PMA/ionomycin उत्तेजना के साथ 4 घंटा तक जोड़ल गइल। इम्यूनोग्लोबुलिन जी (IgG) आ एच 3 के इस्तेमाल क्रमशः नेगेटिव आ पॉजिटिव कंट्रोल के रूप में इम्यूनोप्रेसिपिटेशन खातिर कइल गइल। चिप के मात्रा निर्धारण से पता चलल कि एमएनए से उपचारित कोशिका सभ में TNFα प्रोमोटर से Sp1 आ NFAT के बाइंडिंग नियंत्रण के तुलना में कई गुना बढ़ गइल। कम से कम n = 3 स्वतंत्र प्रयोग से डेटा के प्रतिनिधित्व करेला। कई टी-परीक्षण (*** पी <0.01) द्वारा निर्धारित पी मान। (C) एचजीएससी के जलन के तुलना में, टी कोशिका (गैर-साइटोटोक्सिक) ट्यूमर में टीएनएफ के अभिव्यक्ति में बढ़ोतरी देखाई देलस। रंग अलग-अलग मरीज के प्रतिनिधित्व करेला। प्रदर्शित कोशिका सभ के बेतरतीब तरीका से 300 तक नमूना लिहल गइल बा आ ओवरड्राइंग (** Padj = 0.0076) के सीमित करे खातिर जिटर कइल गइल बा। (D) अंडाशय के कैंसर के लिए एमएनए के प्रस्तावित मॉडल। एमएनए ट्यूमर कोशिका आ टीएमई में फाइब्रोब्लास्ट में बने ला आ टी कोशिका सभ द्वारा लिहल जाला। एमएनए Sp1 के TNFα प्रोमोटर से जुड़ाव बढ़ावे ला, जेकरा चलते TNFα ट्रांसक्रिप्शन आ TNFα साइटोकिन के उत्पादन बढ़ जाला। एमएनए के कारण IFN-γ में भी कमी आवेला। टी सेल के कामकाज में रोकथाम से मारे के क्षमता में कमी आवेला आ ट्यूमर के बढ़े में तेजी आवेला।
रिपोर्ट के मोताबिक, TNFα के आगे आ पीछे पर निर्भर एंटी-ट्यूमर आ एंटी-ट्यूमर प्रभाव होला, बाकी अंडाशय के कैंसर के बढ़ती आ मेटास्टेसिस के बढ़ावा देवे में एकर जानल-मानल भूमिका होला (31-33)। रिपोर्ट के मुताबिक, अंडाशय के कैंसर के मरीज में जलन अवुरी ट्यूमर के ऊतक में TNFα के एकाग्रता सौम्य ऊतक के मुक़ाबले जादे होखेला (34-36)। तंत्र के मामिला में, TNFα सफेद खून के कोशिका सभ के सक्रियण, कामकाज आ प्रसार के नियंत्रित क सके ला आ कैंसर कोशिका सभ के फेनोटाइप में बदलाव क सके ला ( 37 , 38 )। एह निष्कर्षन के अनुरूप, विभेदक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चलल कि जलन के तुलना में ट्यूमर ऊतक में टी कोशिका में टीएनएफ काफी अप-रेगुलेट रहे (चित्र 5 सी)। TNF अभिव्यक्ति में बढ़ोतरी खाली गैर-साइटोटोक्सिक फेनोटाइप (चित्र S5A) के साथ टी कोशिका आबादी में स्पष्ट रहे। संछेप में, ई डेटा एह बिचार के समर्थन करे ला कि एमएनए के एचजीएससी में दोहरी इम्यूनोसप्रेसिव आ ट्यूमर बढ़ावे वाला प्रभाव होला।
फ्लो साइटोमेट्री पर आधारित फ्लोरोसेंट लेबलिंग टीआईएल मेटाबोलिज्म के अध्ययन खातिर मुख्य तरीका बन गइल बा। एह अध्ययन सभ से पता चलल बा कि परिधीय खून के लिम्फोसाइट्स भा सेकेंडरी लिम्फोइड अंग सभ से मिलल टी कोशिका सभ के तुलना में, मूरीन आ मानव टीआईएल में ग्लूकोज के लेवे के प्रवृत्ति ढेर होला (4, 39) आ माइटोकॉन्ड्रिया के कामकाज के धीरे-धीरे नुकसान होला (19, 40)। हालांकि हमनी के ए अध्ययन में भी अयीसने नतीजा देखले बानी, लेकिन एकर प्रमुख विकास एकही रिसेक्टेड ट्यूमर ऊतक से ट्यूमर कोशिका अवुरी टीआईएल के मेटाबॉलिज्म के तुलना कईल बा। एह में से कुछ पिछला रिपोर्ट सभ के अनुरूप, जलन आ ट्यूमर से ट्यूमर (CD45-EpCAM +) कोशिका सभ में ग्लूकोज के लेवे के मात्रा सीडी 8 + आ सीडी 4 + टी कोशिका सभ के तुलना में ढेर होला, ई एह बात के समर्थन करे ला कि ट्यूमर कोशिका सभ के ग्लूकोज के अधिका लेवे के तुलना टी कोशिका सभ से कइल जा सके ला। टी सेल प्रतिस्पर्धा के अवधारणा के बारे में बतावल गईल। टीएमई के बा। हालाँकि, ट्यूमर कोशिका सभ के माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि सीडी 8 + टी कोशिका सभ के तुलना में ढेर होला, बाकी माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि सीडी 4 + टी कोशिका सभ नियर होला। ई परिणाम एह उभरत बिसय के मजबूत करे लें कि ऑक्सीडेटिव मेटाबोलिज्म ट्यूमर कोशिका सभ खातिर महत्वपूर्ण बा ( 41 , 42 )। ई लोग इहो बतावे ला कि सीडी 8 + टी कोशिका सभ सीडी 4 + टी कोशिका सभ के तुलना में ऑक्सीडेटिव डिसफंक्शन के ढेर शिकार हो सके लीं, या फिर सीडी 4 + टी कोशिका सभ माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि के बनावे रखे खातिर ग्लूकोज के अलावा कार्बन स्रोत सभ के इस्तेमाल क सकत बाड़ी ( 43 , 44 )। इहाँ इहो बतावल जरूरी बा कि हमनी के जलन में सीडी 4 + टी इफेक्टर, टी इफेक्टर मेमोरी अवुरी टी सेंट्रल मेमोरी सेल के बीच ग्लूकोज के लेवे चाहे माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि में कवनो अंतर ना देखनी। एही तरे ट्यूमर में सीडी 8 + टी कोशिका के भेदभाव के स्थिति के ग्लूकोज के लेवे में बदलाव से कवनो संबंध नईखे, जवन कि इन विट्रो में संवर्धित टी कोशिका अवुरी इन विवो में मानव टीआईएल के बीच महत्वपूर्ण अंतर के रेखांकित करता ( 22 )। एह निरीक्षण सभ के पुष्टि निष्पक्ष स्वचालित कोशिका आबादी आवंटन के इस्तेमाल से भी भइल, जेकरा से आगे पता चलल कि ट्यूमर कोशिका सभ के तुलना में ग्लूकोज के अधिका लेवे आ माइटोकॉन्ड्रिया गतिविधि वाला CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + कोशिका सभ के प्रचलन होला बाकी इनहन में मेटाबोलिक सक्रिय कोशिका आबादी होला। ई आबादी माइलोइड सप्रेसर कोशिका भा प्लाज्मासाइटोइड डेंड्रिटिक कोशिका सभ के कथित उपजनसंख्या के प्रतिनिधित्व क सके ले जेकर पहिचान scRNA-seq बिस्लेषण में कइल गइल बा। हालाँकि, ई दुनों के रिपोर्ट मानव अंडाशय के ट्यूमर में मिलल बा [45] , इनहन के अबहिन ले जरूरत बा आगे के काम एह माइलोइड उपजनसंख्या के वर्णन करे के बा।
हालाँकि, फ्लो साइटोमेट्री आधारित तरीका से कोशिका प्रकार सभ के बीच ग्लूकोज आ ऑक्सीडेटिव मेटाबोलिज्म में सामान्य अंतर के साफ कइल जा सके ला, टीएमई में माइटोकॉन्ड्रिया मेटाबोलिज्म खातिर ग्लूकोज भा अउरी कार्बन स्रोत सभ द्वारा पैदा होखे वाला सटीक मेटाबोलाइट्स सभ के अबहिन ले निर्धारण नइखे भइल। कौनों दिहल गइल TIL सबसेट में मेटाबोलाइट्स के मौजूदगी भा अनुपस्थिति के असाइन करे खातिर निकालल ऊतक से कोशिका के आबादी के शुद्धिकरण के जरूरत होला। एहसे मास स्पेक्ट्रोमेट्री के संगे मिल के हमनी के कोशिका संवर्धन तरीका से मरीज के नमूना के मिलान में टी कोशिका अवुरी ट्यूमर कोशिका के आबादी में अंतर से समृद्ध होखेवाला मेटाबोलाइट्स के बारे में जानकारी मिल सकता। हालाँकि, एह तरीका के फ्लोरोसेंस-सक्रिय कोशिका छँटाई के तुलना में फायदा बा, कुछ मेटाबोलाइट लाइब्रेरी सभ के निहित स्थिरता आ/या तेजी से टर्नओवर दर के कारण प्रभावित हो सके ला ( 22 )। एकरा बावजूद हमनी के तरीका दुगो मान्यता प्राप्त इम्यूनोसप्रेसिव मेटाबोलाइट्स, एडेनोसाइने अवुरी किनुरेनिन के पहचान करे में सक्षम रहे, काहेंकी नमूना प्रकार के बीच इ बहुत अलग-अलग होखेला।
ट्यूमर अवुरी टीआईएल उपप्रकार के हमनी के मेटाबोनोमिक विश्लेषण से अंडाशय के टीएमई में मेटाबोलाइट्स के भूमिका के बारे में अवुरी जानकारी मिलेला। सबसे पहिले फ्लो साइटोमेट्री के इस्तेमाल से हमनी के इ तय कईनी कि ट्यूमर अवुरी सीडी 4 + टी कोशिका के बीच माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि में कवनो अंतर नईखे। हालाँकि, एलसी-एमएस/एमएस बिस्लेषण से एह आबादी सभ में मेटाबोलाइट्स के बहुतायत में काफी बदलाव देखल गइल, ई बतावे ला कि टीआईएल मेटाबोलिज्म आ एकरे समग्र मेटाबोलिक गतिविधि के बारे में निष्कर्ष निकाले खातिर सावधानीपूर्वक व्याख्या करे के जरूरत बा। दूसरा, एमएनए मेटाबोलाइट ह जवना में जलन में सीडी 45-कोशिका अवुरी टी कोशिका में सबसे जादे अंतर होखेला, ट्यूमर में ना। एह से, डिब्बाबंदी आ ट्यूमर के लोकेशन के टीआईएल मेटाबोलिज्म पर अलग-अलग परभाव हो सके ला, जवन कौनों दिहल गइल सूक्ष्म वातावरण में संभावित बिसमरूपता के रेखांकित करे ला। तीसरा, एमएनए पैदा करे वाला एंजाइम एनएनएमटी के एक्सप्रेशन मुख्य रूप से सीएएफ तक सीमित होला, जवन कम हद तक ट्यूमर कोशिका हवे, बाकी ट्यूमर से निकलल टी कोशिका सभ में पता लगावे लायक एमएनए के स्तर देखल जाला। अंडाशय के सीएएफ में एनएनएमटी के ओवरएक्सप्रेशन के कैंसर के बढ़ावा देवे वाला प्रभाव के बारे में जानल जाला, एकर कारण कुछ हद तक सीएएफ मेटाबॉलिज्म, ट्यूमर के आक्रमण अवुरी मेटास्टेसिस के बढ़ावा मिलेला ( 27 )। हालाँकि, TIL के समग्र स्तर मध्यम होला, CAF में NNMT के एक्सप्रेशन कैंसर जीनोम एटलस (TCGA) मेसेंकिमल सबटाइप से बहुत नजदीक से संबंधित होला, जवन खराब प्रोग्नोसिस से जुड़ल होला ( 27 , 46 , 47 )। अंत में, एमएनए के गिरावट खातिर जिम्मेदार एंजाइम AOX1 के एक्सप्रेशन भी CAF आबादी तक ले सीमित होला, ई बतावे ला कि टी कोशिका सभ में एमएनए के चयापचय करे के क्षमता के कमी होला। ई परिणाम एह बिचार के समर्थन करे लें कि हालाँकि, एह खोज के सत्यापन खातिर अउरी काम के जरूरत बा, टी कोशिका सभ में एमएनए के उच्च स्तर इम्यूनोसप्रेसिव सीएएफ माइक्रोइंवायरमेंट के मौजूदगी के संकेत दे सके ला।
एमएनए ट्रांसपोर्टर सभ के कम एक्सप्रेशन लेवल आ एमएनए मेटाबोलिज्म में शामिल प्रमुख प्रोटीन सभ के अज्ञात स्तर के देखत, टी कोशिका सभ में एमएनए के मौजूदगी अप्रत्याशित बा। दू गो स्वतंत्र कोहोर्ट के scRNA-seq विश्लेषण आ लक्षित qPCR से ना त एनएनएमटी आ ना ही एओएक्स1 के पता लगावल जा सकल। ई परिणाम बतावे लें कि एमएनए टी कोशिका सभ द्वारा संश्लेषित ना होला, बलुक आसपास के टीएमई से सोख लिहल जाला। इन विट्रो प्रयोग से पता चलेला कि टी कोशिका में बहिर्जात एमएनए जमा होखे के प्रवृत्ति होला।
हमनी के इन विट्रो अध्ययन से पता चलल बा कि बहिर्जात एमएनए टी कोशिका में TNFα के अभिव्यक्ति के प्रेरित करेला अवुरी Sp1 के TNFα प्रोमोटर से जुड़ाव के बढ़ावेला। हालाँकि, TNFα में एंटी-ट्यूमर आ एंटी-ट्यूमर दुनों कामकाज होला, अंडाशय के कैंसर में, TNFα अंडाशय के कैंसर के बढ़ती के बढ़ावा दे सके ला ( 31-33 )। अंडाशय के ट्यूमर कोशिका संस्कृति में TNFα के बेअसर कइल भा माउस मॉडल में TNFα सिग्नल के खतम कइल TNFα-मध्यस्थता वाला भड़काऊ साइटोकिन उत्पादन में सुधार क सके ला आ ट्यूमर के बढ़ती में बाधा डाल सके ला ( 32 , 35 )। एह से, एह मामला में, टीएमई से निकलल एमएनए ऑटोक्राइन लूप के माध्यम से टीएनएफα-निर्भर तंत्र के माध्यम से प्रो-इंफ्लेमेटरी मेटाबोलाइट के रूप में काम क सके ला, जेकरा से अंडाशय के कैंसर के होखे आ फइलल के बढ़ावा मिले ला ( 31 )। एह संभावना के आधार पर, TNFα नाकाबंदी के अध्ययन अंडाशय के कैंसर खातिर संभावित चिकित्सीय एजेंट के रूप में कइल जा रहल बा (37, 48, 49)। एकरे अलावा, एमएनए अंडाशय के ट्यूमर कोशिका सभ के सीएआर-टी कोशिका सभ के साइटोटोक्सिसिटी के बिगाड़ देला, जेकरा से एमएनए-मध्यस्थ प्रतिरक्षा दमन के अउरी सबूत मिले ला। सामूहिक रूप से ई परिणाम एगो मॉडल के सुझाव देलें जेह में ट्यूमर आ सीएएफ कोशिका सभ एमएनए के स्राव बाह्य कोशिका टीएमई में करे लीं। (i) TNF-प्रेरित अंडाशय कैंसर के बढ़ती के उत्तेजना आ (ii) MNA-प्रेरित टी सेल साइटोटोक्सिक गतिविधि निरोध के माध्यम से, एकर दोहरी ट्यूमर प्रभाव हो सके ला (चित्र 5D)।
निष्कर्ष में, तेजी से कोशिका संवर्धन, एकल कोशिका अनुक्रमण अवुरी मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग के संयोजन के लागू क के ए अध्ययन में एचजीएससी के मरीज में ट्यूमर अवुरी जलन कोशिका के बीच बहुत बड़ इम्यूनोमेटाबोलोमिक अंतर के पता चलल। एह व्यापक बिस्लेषण से पता चलल कि टी कोशिका सभ के बीच ग्लूकोज के लेवे आ माइटोकॉन्ड्रिया के गतिविधि में अंतर होला, आ एमएनए के गैर-कोशिका स्वायत्त प्रतिरक्षा रेगुलेटरी मेटाबोलाइट के रूप में पहिचान कइल गइल। एह डेटा के असर एह बात पर पड़ेला कि टीएमई मानव कैंसर में टी सेल मेटाबोलिज्म के कइसे प्रभावित करेला। हालाँकि, टी कोशिका आ कैंसर कोशिका सभ के बीच पोषक तत्व सभ खातिर सीधा प्रतिस्पर्धा के रिपोर्ट कइल गइल बा, मेटाबोलाइट्स ट्यूमर के बढ़ती के बढ़ावा देवे आ संभवतः अंतर्जात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया सभ के दबावे खातिर अप्रत्यक्ष नियामक के रूप में भी काम क सके लें। एह रेगुलेटरी मेटाबोलाइट्स के कामकाजी भूमिका के आगे के बिबरन से एंटी-ट्यूमर इम्यून रिस्पांस बढ़ावे खातिर वैकल्पिक रणनीति खुल सके ला।
मरीजन के नमूना आ नैदानिक ​​डेटा कनाडा के ऊतक भंडार नेटवर्क द्वारा प्रमाणित बीसी कैंसर ट्यूमर ऊतक भंडार के माध्यम से लिहल गइल। बीसी कैंसर रिसर्च एथिक्स कमेटी अवुरी यूनिवर्सिटी ऑफ ब्रिटिश कोलंबिया (H07-00463) के मंजूर प्रोटोकॉल के मुताबिक, सभ मरीज के नमूना अवुरी क्लिनिकल डेटा के सूचित लिखित सहमति मिलल चाहे औपचारिक तौर प सहमति माफ क दिहल गईल। नमूना के प्रमाणित बायोबैंक (बीआरसी-00290) में संग्रहीत कईल जाला। रोगी के विस्तृत विशेषता तालिका S1 आ S5 में देखावल गइल बा। क्रायोप्रिजर्वेशन खातिर स्केलपेल के इस्तेमाल से मरीज के ट्यूमर के नमूना के यांत्रिक रूप से सड़ल जाला आ फिर ओकरा के 100 माइक्रोन के फिल्टर से धकेल के एकही कोशिका निलंबन मिल जाला। रोगी के जलन के 1500 आरपीएम पर 4°C पर 10 मिनट ले सेंट्रीफ्यूज कइल गइल ताकि कोशिका सभ के गोली बनावल जा सके आ सुपरनेटेंट के हटावल जा सके। ट्यूमर आ जलन से मिलल कोशिका सभ के 50% गर्मी से निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 40% आरपीएमआई-1640 (थर्मो फिशर साइंटिफिक) आ 10% डाइमिथाइल सल्फोक्साइड में क्रायोप्रिजर्व कइल गइल। एह संरक्षित एकल कोशिका निलंबन सभ के पिघला के नीचे बतावल गइल मेटाबोलोमिक्स आ मेटाबोलाइट निर्धारण खातिर इस्तेमाल कइल गइल।
पूरा माध्यम में 0.22 माइक्रोन फिल्टर कइल 50:50 पूरक आरपीएमआई 1640: AimV होला। आरपीएमआई 1640 + 2.05 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के पूरक 10% गर्मी से निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच), 12.5 मिमी हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक), 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) फिशर साइंटिफिक), 1 एक्स पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेनस्ट्रेप) घोल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) आ 50 μMB-मर्कैप्टोइथेनॉल। AimV (इन्विट्रोजन) के 20 mM हेपेस (थर्मो फिशर साइंटिफिक) आ 2 mM एल-ग्लूटामाइन (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के पूरक दिहल जाला। फ्लो साइटोमीटर धुंधलापन बफर में 0.22μm फिल्टर फॉस्फेट बफर खारा (PBS; Invitrogen) के पूरक 3% गर्मी-निष्क्रिय एबी मानव सीरम (सिग्मा) के साथ शामिल रहे। कोशिका संवर्धन बफर 0.22μm फिल्टर कइल पीबीएस से बनल होला आ 0.5% गर्मी से निष्क्रिय मानव एबी सीरम (सिग्मा-एल्ड्रिच) के पूरक होला।
37°C पूरा माध्यम में, कोशिका के 10 एनएम एमटी डीआर आ 100 μM 2-एनबीडीजी से 30 मिनट तक रंगाई कइल गइल। एकरे बाद, कोशिका सभ के 4°C पर 15 मिनट ले व्यवहार्यता डाई eF506 से रंगाई कइल गइल। कोशिका सभ के एफसी ब्लॉक (ईबायोसाइंस) आ ब्रिलियंट स्टेन बफर (बीडी बायोसाइंसेज) में फिर से निलंबित करीं, फ्लो साइटोमीटर स्टेनिंग बफर में पतला करीं (निर्माता के निर्देश के अनुसार), आ कमरा के तापमान पर 10 मिनट ले इन्क्यूबेट करीं। कोशिका के एंटीबॉडी के सेट (तालिका S2) के साथ फ्लो साइटोमेट्री धुंधला बफर में 4°C पर 20 मिनट तक रंगाई। विश्लेषण से पहिले फ्लो साइटोमेट्री धुंधला बफर (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R विन्यास) में कोशिका के फिर से निलंबित करीं। सेल काउंट डेटा के विश्लेषण करे खातिर स्पेक्ट्रोफ्लो आ फ्लोजो वी10 के इस्तेमाल करीं, आ डेटा बनावे खातिर ग्राफपैड प्रिज्म 8 के इस्तेमाल करीं। 2-एनबीडीजी आ एमटी डीआर के मीडियन फ्लोरोसेंस तीव्रता (MFI) के लॉग-नॉर्मलाइज कइल गइल, आ फिर मिलान कइल मरीजन के हिसाब देवे खातिर सांख्यिकीय विश्लेषण खातिर पेयर टी टेस्ट के इस्तेमाल कइल गइल। 40 से कम घटना वाला सगरी आबादी सभ के बिस्लेषण से हटा दिहल जाय; सांख्यिकीय विश्लेषण आ डेटा विजुअलाइजेशन करे से पहिले कवनो भी नकारात्मक मान खातिर 1 के एमएफआई मान दर्ज करीं।
उपरोक्त प्रक्रिया पैनल के मैनुअल गेटिंग रणनीति के पूरक के क्रम में, हमनी के आकृति प्रतिबंध पेड़ (FAUST) (21) द्वारा पूरा एनोटेशन के इस्तेमाल कइनी जा ताकि FlowJo में मृत कोशिका के समाप्त कइला के बाद कोशिका के स्वचालित रूप से आबादी में असाइन कइल जा सके। हमनी के मैन्युअल रूप से आउटपुट के प्रबंधित क के अइसन आबादी सभ के मर्ज करे लीं जे गलत तरीका से आवंटित लउके लीं (पीडी 1 + के पीडी 1-ट्यूमर कोशिका सभ के साथ संयोजन) आ बरकरार आबादी। हर नमूना में औसतन 2% से ढेर कोशिका होलीं, कुल 11 आबादी खातिर।
ल्यूकोसाइट अलग करे वाला उत्पाद (STEMCELL टेक्नोलॉजीज) से पीबीएमसी के अलग करे खातिर फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन के इस्तेमाल कइल गइल। सीडी 8 + टी कोशिका सभ के पीबीएमसी से सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) के इस्तेमाल से अलग कइल गइल आ निर्माता के निर्देश के अनुसार ट्रांसएक्ट (मिल्टेनी) के इस्तेमाल से पूरा माध्यम में 2 हप्ता ले बिस्तार कइल गइल। कोशिका सभ के आईएल-7 (10 एनजी/एमएल; पेप्रोटेक) वाला पूरा माध्यम में 5 दिन ले खड़ा होखे दिहल गइल, आ फिर ट्रांसएक्ट से फिर से उत्तेजित कइल गइल। 7वां दिन निर्माता के निर्देश के मुताबिक लगातार तीन दौर में कोशिका के समृद्ध करे खाती मानव सीडी45 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) के इस्तेमाल कईल गईल। कोशिका सभ के फ्लो साइटोमेट्री बिस्लेषण खातिर एलिकोट कइल गइल (जइसे कि ऊपर बतावल गइल बा), आ दस लाख कोशिका सभ के एलसी-एमएस/एमएस बिस्लेषण खातिर तीन बेर एलिकोट कइल गइल। नमूना सभ के एलसी-एमएस/एमएस द्वारा प्रोसेस कइल गइल जइसन कि नीचे बतावल गइल बा। हमनी के 1,000 के आयन संख्या के संगे गायब मेटाबोलाइट मान के अनुमान लगवनी। हर नमूना के कुल आयन संख्या (TIC) से सामान्य कइल जाला, लघुगणकीय रूप से बदलल जाला आ विश्लेषण से पहिले मेटाबोएनालिस्टआर में स्वचालित रूप से सामान्य कइल जाला।
हर मरीज के एकल कोशिका निलंबन के पिघला के 40 μm फिल्टर के माध्यम से पूरा माध्यम (जइसे कि ऊपर बतावल गइल बा) में छानल गइल। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, सीडी 8+, सीडी 4+ आ सीडी 45- कोशिका (बरफ पर) खातिर नमूना के समृद्ध करे खातिर माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) के इस्तेमाल से चुंबकीय बीड अलगाव द्वारा लगातार तीन दौर के सकारात्मक चयन के इस्तेमाल कइल गइल। संक्षेप में कहल जाय तब कोशिका सभ के कोशिका संवर्धन बफर (जइसे कि ऊपर बतावल गइल बा) में फिर से लटका दिहल जाला आ गिनल जाला। कोशिका सभ के मानव सीडी 8 बीड्स, मानव सीडी 4 बीड्स भा मानव सीडी 45 बीड्स (मिल्टेनी) के साथ 4°C पर 15 मिनट ले इन्क्यूबेट कइल गइल, आ फिर कोशिका संवर्धन बफर से धोवल गइल। नमूना के एलएस कॉलम (मिल्टेनी) से गुजारल जाला, आ सकारात्मक आ नकारात्मक अंश सभ के एकट्ठा कइल जाला। अवधि के कम करे आ कोशिका के रिकवरी स्टेप के अधिकतम करे खातिर, एकरे बाद सीडी 8-अंश के इस्तेमाल सीडी 4+ संवर्धन के दुसरा दौर खातिर कइल जाला आ सीडी 4-अंश के इस्तेमाल बाद के सीडी 45-संवर्धन खातिर कइल जाला। अलग करे के पूरा प्रक्रिया में घोल के बर्फ पर रखे के चाहीं।
मेटाबोलाइट बिस्लेषण खातिर नमूना सभ के तइयार करे खातिर कोशिका सभ के एक बेर बर्फ के ठंडा नमक के घोल से धोवल गइल आ हर नमूना में 1 मिलीलीटर 80% मेथनॉल मिलावल गइल, फिर भंवर कइल गइल आ तरल नाइट्रोजन में स्नैप फ्रीज कइल गइल। नमूना सभ के तीन गो फ्रीज-थॉ चक्र कइल गइल आ 4°C पर 14,000 आरपीएम पर 15 मिनट ले सेंट्रीफ्यूज कइल गइल। मेटाबोलाइट्स वाला सुपरनेटेंट के सूखे तक वाष्पित कइल जाला। मेटाबोलाइट्स के 50 μl 0.03% फॉर्मिक एसिड में फिर से घोल के, भंवर से मिला के मिलावल गइल आ फिर सेंट्रीफ्यूज क के मलबा हटा दिहल गइल।
ऊपर बतावल तरीका से मेटाबोलाइट्स निकालल जाला। मेटाबोलोमिक्स रिसर्च खातिर सुपरनेटेंट के हाई परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी बोतल में स्थानांतरित करीं। बैच प्रभाव के रोके खातिर हर नमूना के समान संख्या में कोशिका के साथ इलाज करे खातिर रैंडम ट्रीटमेंट प्रोटोकॉल के इस्तेमाल करीं। हमनी के एबी SCIEX QTRAP 5500 ट्रिपल क्वाड्रपोल मास स्पेक्ट्रोमीटर (50) प पहिले प्रकाशित वैश्विक मेटाबोलाइट्स के गुणात्मक आकलन कईनी। क्रोमैटोग्राफिक विश्लेषण आ पीक एरिया एकीकरण मल्टीक्वांट संस्करण 2.1 सॉफ्टवेयर (एप्लाइड बायोसिस्टम्स एससीआईईएक्स) के इस्तेमाल से कइल गइल।
गायब मेटाबोलाइट मान के अनुमान लगावे खातिर 1000 के आयन गिनती के इस्तेमाल कइल गइल आ हर नमूना के टीआईसी के इस्तेमाल हर पता लगावल गइल मेटाबोलाइट के सामान्यीकृत पीक एरिया के गणना करे खातिर कइल गइल ताकि नमूना प्रोसेसिंग से इंस्ट्रूमेंटल एनालिसिस से आइल बदलाव के सही कइल जा सके। TIC के सामान्य कइला के बाद, लघुगणकीय रूपांतरण आ स्वचालित नॉर्म लाइन स्केलिंग खातिर MetaboAnalystR(51) (डिफ़ॉल्ट पैरामीटर) के इस्तेमाल कइल जाला। हमनी के नमूना प्रकार के बीच मेटाबोलोम अंतर के अन्वेषणात्मक विश्लेषण करे खातिर शाकाहारी आर पैकेज के संगे पीसीए के इस्तेमाल कईनी, अवुरी मरीज के विश्लेषण करे खाती आंशिक रिडंडेंसी विश्लेषण के इस्तेमाल कईनी। नमूना सभ के बीच के यूक्लिडियन दूरी के क्लस्टर करे खातिर हीट मैप डेंड्रोग्राम बनावे खातिर वार्ड तरीका के इस्तेमाल करीं। हमनी के पूरा कोशिका प्रकार अवुरी सूक्ष्म वातावरण में अंतर से प्रचुर मात्रा में मेटाबोलाइट्स के पहचान करे खाती मानकीकृत मेटाबोलाइट प्रचुरता प लिम्मा (52) के इस्तेमाल कईनी। व्याख्या के सरल बनावे खातिर, हमनी के मॉडल के निर्दिष्ट करे खातिर समूह औसत पैरामीटर के इस्तेमाल करे लीं, आ सूक्ष्म वातावरण में कोशिका प्रकार सभ के हर समूह (n = 6 समूह) के रूप में बिचार करे लीं; महत्व परीक्षण खातिर, हमनी के हर मेटाबोलाइट खातिर तीन बार-बार माप कईनी जा झूठा प्रतिकृति से बचे खातिर, रोगी के लिमा डिजाइन में बाधा के रूप में शामिल कईल गईल। अलग-अलग मरीज के बीच मेटाबोलाइट्स में अंतर के जांच करे खाती हमनी के मरीज समेत लिम्मा मॉडल के निश्चित तरीका से समायोजित कईनी। हमनी के कोशिका प्रकार अवुरी Padj <0.05 (बेंजामिनी-होचबर्ग सुधार) के सूक्ष्म वातावरण के बीच पूर्व-निर्दिष्ट विपरीत के महत्व के रिपोर्ट करतानी।
मिलटेनी डेड सेल रिमूवल किट (>80% व्यवहार्यता) के इस्तेमाल से जोश संवर्धन के बाद, 10x 5′जीन एक्सप्रेशन प्रोटोकॉल के इस्तेमाल से कुल जिंदा जमल जलन आ ट्यूमर नमूना सभ पर सिंगल-सेल ट्रांसक्रिप्टोम अनुक्रमण कइल गइल। ट्यूमर आ जलन के मिलान वाला पाँच गो मामिला के विश्लेषण कइल गइल, हालाँकि, एक ठो ट्यूमर नमूना से कम व्यवहार्यता के कारण एकरा के शामिल ना कइल गइल। मरीजन के कई गो चयन हासिल करे खातिर हमनी का हर मरीज के नमूना के 10x क्रोमियम कंट्रोलर के लेन में मिला दिहनी जा, आ जलन आ ट्यूमर साइट के अलग अलग विश्लेषण कइनी जा. अनुक्रमण के बाद [इलुमिना HiSeq 4000 28×98 बीपी जोड़ीदार अंत (पीई), क्यूबेक जीनोम; ट्यूमर आ जलन खातिर औसतन 73,488 आ 41,378 रीड्स प्रति कोशिका क्रमशः]], हमनी के CellSNP आ Vireo (53) (CelSNP के आधार पर के रूप में GRCh38 द्वारा उपलब्ध करावल गइल आम मानव SNP (VCF) के एगो दाता पहचान सौंपल गइल बा। हमनी के SNPRelate के इस्तेमाल रोगी के जीनोटाइप स्थिति (IBS) के सबसे नजदीकी पहचान (IBS) के अनुमान लगावे खातिर, बिना असाइन कइल कोशिका आ डुप्लेक्स के रूप में पहचानल कोशिका आ जलन आ ट्यूमर नमूना ( 54 ) के बीच मिलान दाता के छोड़ के एह काम के आधार पर, हमनी के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण खातिर ट्यूमर आ जलन में भरपूर कोशिका प्रतिनिधित्व के साथ तीन मामला के बरकरार रखनी जा, स्कैटर (55) आ स्क्रैन (56) बायोकंडक्टर पैकेजिंग में एगो मास छाननी कदम प्रदर्शन के बाद, एह से 697 कोशिका पैदा भइल (2792 आ 4183 कोशिका, क्रमशः) विश्लेषण खातिर हमनी के अभिव्यक्ति द्वारा समूह कोशिका के जैकार्ड दूरी के आधार पर आईग्राफ के (57) लूवेन समूहीकरण के इस्तेमाल करेनी जा सीडी 8 ए आ जीजेडएमए के अभिव्यक्ति से परिभाषित, कम राइबोसोमल प्रोटीन अभिव्यक्ति वाला उपसमूह के छोड़ के, हमनी के इज़ार एट अल (16) के प्रकाशित डेटा तक पहुंचनी जा, जवना में उनके टी-एसएनई एम्बेडिंग भी शामिल बा, प्रतिरक्षा कोशिका मार्कर अवुरी एनएनएमटी अभिव्यक्ति के बीच अभिव्यक्ति ओवरलैप के नियंत्रित क सकता।
पीबीएमसी के ल्यूकोसाइट अलग करे वाला उत्पाद (STEMCELL Technologies) से फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग कइल गइल। सीडी 3 + कोशिका के सीडी 3 बीड्स (मिल्टेनी) के उपयोग से पीबीएमसी से अलग कइल गइल। एमएनए के मौजूदगी भा अनुपस्थिति में, सीडी 3 + कोशिका सभ के प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5μg/ml), घुलनशील सीडी 28 (3μg/ml) आ आईएल-2 (300 U/ml; प्रोल्यूकिन) के साथ सक्रिय कइल गइल। बिस्तार के अंतिम दिन, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा व्यवहार्यता (फिक्सेबल वाइबिलिटी डाई eFluor450, eBioscience) आ प्रसार (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) के मूल्यांकन कइल गइल। गोल्गीस्टॉप के साथ पीएमए (20 एनजी/एमएल) आ आयनोमाइसिन (1μg/एमएल) के साथ कोशिका सभ के 4 घंटा ले उत्तेजित क के इफेक्टर फंक्शन के मूल्यांकन करीं, आ सीडी 8-परसीपी (आरपीए-टी8, बायोलेजेंड), सीडी 4-एएफ700 (आरपीए-टी4) , बायोलेजेंड) आ टीएनएफα-फ्लोरोसेइन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) (एमएबी11, बीडी) के निगरानी करीं। क्यूपीसीआर आ चिप कोशिका के पीएमए (20 एनजी/एमएल) आ आयनोमाइसिन (1μg/एमएल) से 4 घंटा तक उत्तेजित करीं। एलिसा सुपरनेटेंट के पीएमए (20 एनजी/एमएल) आ आयनोमाइसिन (1 माइक्रोग्राम/एमएल) के साथ 4 घंटा तक उत्तेजना से पहिले आ बाद में एकट्ठा कइल गइल।
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) के इस्तेमाल से आरएनए के अलग करे खातिर निर्माता के प्रोटोकॉल के पालन करीं। नमूना के एकरूप बनावे खातिर QIAshredder (QIAGEN) के इस्तेमाल करीं। पूरक डीएनए (सीडीएनए) के संश्लेषण खातिर उच्च क्षमता वाला आरएनए से सीडीएनए किट (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के इस्तेमाल करीं। निम्नलिखित जांच के साथ जीन अभिव्यक्ति (निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार) के मात्रा निर्धारित करे खातिर TaqMan रैपिड एडवांस्ड मास्टर मिक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के इस्तेमाल करीं: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [हाइड्रोजन (GAPDH) बंद ग्लिसरल्डीहाइड-3-फॉस्फेट] आ Hs01010726_m1 (SLC22A2)। नमूना सभ के माइक्रोएम्प ऑप्टिकल फिलिम के साथ माइक्रोएम्प फास्ट ऑप्टिकल 96-वेल रिएक्शन प्लेट (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) में स्टेपवनप्लस रियल-टाइम पीसीआर सिस्टम (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) (एप्लाइड बायोसिस्टम्स) पर चलावल गइल। कौनों भी Ct मान जे 35 से ढेर होखे तब डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड से ऊपर मानल जाला आ एकरा के अनडिटेक्टेबल के रूप में चिन्हित कइल जाला।
चिप के निष्पादन करीं जइसन कि पहिले बतावल गइल बा (58)। संक्षेप में, कोशिका सभ के फॉर्मेल्डीहाइड (अंतिम एकाग्रता 1.42%) से उपचार कइल गइल आ कमरा के तापमान पर 10 मिनट ले इन्क्यूबेट कइल गइल। 10 मिनट तक बर्फ पर पूरक सूजन बफर (25 मिमी हेपस, 1.5 मिमी MgCl2, 10 मिमी KCl और 0.1% एनपी-40) का उपयोग करें, फिर इम्यूनोप्रेसिपिटेशन बफर में फिर से लटकाएं जैसा कि वर्णित (58)। एकरे बाद नमूना के निम्नलिखित चक्र सभ के साथ सोनिकेशन कइल गइल: 10 चक्र (20 1-सेकंड के पल्स) आ 40 सेकंड के स्थिर समय। ChIP-ग्रेड इम्यूनोग्लोबुलिन जी (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 1μl), हिस्टोन एच3 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl), NFAT (इन्विट्रोजन; 3μl) आ SP1 (सेल सिग्नलिंग टेक्नोलॉजी; 3μl) एंटीबॉडी सभ के नमूना के साथ रात भर 4°CC शेक पर इनक्यूबेट करीं। प्रोटीन ए बीड्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के नमूना के साथ 4°C पर 1 घंटा ले हल्का हिला के इन्क्यूबेट करीं, फिर डीएनए के समृद्ध करे खातिर चेलेक्स बीड्स (बायो-रैड) के इस्तेमाल करीं, आ प्रोटीन के पाचन खातिर प्रोटीनेज के (थर्मो फिशर) के इस्तेमाल करीं। TNFα प्रोमोटर के पीसीआर द्वारा पता लगावल गइल: आगे, जीजीजी टैट सीसीटी टीजीए टीजीसी टीटीजी टीजीटी; एकरा उलट, जीटीजी सीसीए एसीए एक्ट जीसीसी टीटीटी एटीए टीजी (207-बीपी उत्पाद)। इमेज सभ के निर्माण इमेज लैब (बायो-रैड) द्वारा कइल गइल आ इमेजजे सॉफ्टवेयर के इस्तेमाल से एकर मात्रा निर्धारित कइल गइल।
सेल कल्चर सुपरनेटेंट के ऊपर बतावल तरीका से एकट्ठा कइल गइल। निर्धारण मानव TNFα एलिसा किट (Invitrogen), मानव IL-2 ELISA किट (Invitrogen) आ मानव IFN-γ ELISA किट (Abcam) के निर्माता के प्रक्रिया के अनुसार कइल गइल। निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, सुपरनेटेंट के 1:100 पतला क के TNFα आ IL-2 के पता लगावल गइल, आ 1:3 के पतला क के IFN-γ के पता लगावल गइल। 450 एनएम पर अवशोषण के माप खातिर एनविजन 2104 मल्टीलेबल रीडर (पर्किनएलमर) के इस्तेमाल करीं।
पीबीएमसी के ल्यूकोसाइट अलगाव उत्पाद (STEMCELL टेक्नोलॉजीज) से फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग कइल गइल। सीडी 3 + कोशिका के सीडी 3 बीड्स (मिल्टेनी) के उपयोग से पीबीएमसी से अलग कइल गइल। एमएनए के मौजूदगी भा अनुपस्थिति में, सीडी 3 + कोशिका सभ के प्लेट-बाउंड सीडी 3 (5μg/ml), घुलनशील सीडी 28 (3μg/ml) आ आईएल-2 (300 U/ml; प्रोल्यूकिन) के साथ 3 दिन ले सक्रिय कइल गइल। 3 दिन के बाद कोशिका सभ के एकट्ठा क के 0.9% खारा पानी से धोवल गइल, आ गोली के स्नैप फ्रीज कइल गइल। कोशिका गिनती 123count eBeads के उपयोग से फ्लो साइटोमेट्री (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R कॉन्फ़िगरेशन) द्वारा कइल गइल।
ऊपर बतावल तरीका से मेटाबोलाइट्स निकालल जाला। सूखे अर्क के 4000 कोशिका समकक्ष/μl के एकाग्रता में पुनर्गठित कइल गइल। रिवर्स-फेज क्रोमैटोग्राफी (1290 इन्फिनिटी II, एजिलेंट टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, सीए) आ CORTECS T3 कॉलम (2.1×150 मिमी, कण आकार 1.6-μm, छिद्र आकार 120-Å; #186008500, वाटर्स) द्वारा नमूना के विश्लेषण करीं। ध्रुवीय मास स्पेक्ट्रोमीटर (6470, एजिलेंट), जवना में इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण सकारात्मक मोड में काम करेला। मोबाइल फेज ए में 0.1% फॉर्मिक एसिड (H2O में), मोबाइल फेज बी में 90% एसीटोनिट्राइल, 0.1% फॉर्मिक एसिड होला। एलसी ढाल 100% ए खातिर 0 से 2 मिनट, 99% बी खातिर 2 से 7.1 मिनट, आ 99% बी खातिर 7.1 से 8 मिनट होला फिर मोबाइल फेज ए के साथ कॉलम के 3 मिनट खातिर 0.6 मिलीलीटर/मिनट के प्रवाह दर पर फिर से संतुलित करीं। . प्रवाह दर 0.4ml/min होला, आ कॉलम कक्ष के 50°C तक गरम कइल जाला। रिटेन टाइम (RT) आ रूपांतरण (RT = 0.882 मिनट, रूपांतरण 1 = 137→94.1, रूपांतरण 2 = 137→92 , रूपांतरण 3 = 137→78) स्थापित करे खातिर MNA के शुद्ध रासायनिक मानक (M320995, टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी, नॉर्थ यार्क, ओंटारियो, कनाडा) के इस्तेमाल करीं। जब तीनों संक्रमण सही रिटेन समय पर होखे तब संक्रमण 1 के इस्तेमाल मात्रा निर्धारण खातिर कइल जाला ताकि बिसेसता सुनिश्चित कइल जा सके। एमएनए (टोरंटो रिसर्च केमिकल कंपनी) के मानक वक्र के स्टॉक घोल (1 मिलीग्राम/एमएल) के छह गो सीरियल पतलापन से पैदा कइल गइल ताकि क्रम से 0.1, 1.0, 10 आ 100 एनजी/एमएल आ 1.0 आ 10μg/एमएल तरल के मानक मिलल। पता लगावे के सीमा 1 एनजी/एमएल होला, आ रेखीय प्रतिक्रिया 10 एनजी/एमएल से 10μg/एमएल के बीच होला। दू माइक्रोलीटर नमूना आ मानक के हर इंजेक्शन के इस्तेमाल एलसी/एमएस विश्लेषण खातिर कइल जाला आ हर आठ इंजेक्शन पर एगो मिश्रित गुणवत्ता नियंत्रण नमूना चलावल जाला ताकि विश्लेषण मंच के स्थिरता सुनिश्चित कइल जा सके। सभ एमएनए-उपचारित कोशिका नमूना के एमएनए प्रतिक्रिया परख के रेखीय सीमा के भीतर रहे। डेटा विश्लेषण मासहंटर मात्रात्मक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (v9.0, एजिलेंट) के उपयोग से कइल गइल।
दूसरी पीढ़ी के αFR-CAR निर्माण सोंग एट अल से लिहल गइल। (59) के बा। संछेप में, एह निर्माण में निम्नलिखित सामग्री होले: सीडी 8ए लीडर सीक्वेंस, मानव αFR-विशिष्ट सिंगल-चेन चर टुकड़ा, सीडी 8ए काज आ ट्रांसमेम्ब्रेन क्षेत्र, सीडी 27 इंट्रासेलुलर डोमेन आ सीडी 3जेड इंट्रासेलुलर डोमेन। पूरा सीएआर अनुक्रम के जेनस्क्रिप्ट द्वारा संश्लेषित कइल गइल, आ फिर ट्रांसडक्शन दक्षता के मूल्यांकन खातिर इस्तेमाल कइल गइल जीएफपी एक्सप्रेशन कैसेट के अपस्ट्रीम दूसरी पीढ़ी के लेंटिवायरस एक्सप्रेशन वेक्टर में क्लोन कइल गइल।
लेन्टीवायरस HEK293T कोशिका सभ के ट्रांसफेक्टेशन से पैदा होला [अमेरिकन टाइप कल्चर कलेक्शन (ATCC); दुलबेको के संशोधित ईगल मीडियम में उगावल जाला जेह में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) आ 1% पेनस्ट्रेप होला, आ CAR-GFP वेक्टर के इस्तेमाल कइल जाला आ पैकेजिंग प्लाज्मिड (psPAX2 आ pMD2.G, Addgene) सभ में लिपोफेक्शन अमाइन (Sigma-Aldrich) के इस्तेमाल होला। वायरस युक्त सुपरनेटेंट के ट्रांसफेक्टेशन के 48 आ 72 घंटा बाद एकट्ठा कइल गइल, छानल गइल आ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गाढ़ कइल गइल। गाढ़ वायरल सुपरनेटेंट के -80°C पर ट्रांसडक्शन तक स्टोर करीं।
पीबीएमसी के स्वस्थ दाता ल्यूकोसाइट अलग करे वाला उत्पाद (STEMCELL Technologies) से फिकोल ढाल घनत्व सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा अलग कइल जाला। पीबीएमसी से सीडी 8+ कोशिका के अलग करे खातिर सकारात्मक चयन सीडी 8 माइक्रोबीड्स (मिल्टेनी) के इस्तेमाल करीं। ट्रांसएक्ट (मिल्टेनी) के साथ आ टेक्समैक्स माध्यम में टी कोशिका के उत्तेजित करीं [मिल्टेनी; 3% गर्मी से निष्क्रिय मानव सीरम, 1% पेनस्ट्रेप आ आईएल-2 (300 U/ml) के पूरक]। उत्तेजना के चौबीस घंटा बाद, टी कोशिका के लेन्टीवायरस (10 μl गाढ़ वायरस सुपरनेटेंट प्रति 106 कोशिका) के साथ ट्रांसड्यूस कइल गइल। साइटेक अरोड़ा (एफएससी (फोरवर्ड स्कैटर)/एसएससी (साइड स्कैटर), सिंगलेट, जीएफपी + पर ट्रांसडक्शन के 1 से 3 दिन बाद, कम से कम 30% के ट्रांसडक्शन दक्षता के प्रदर्शन करे खातिर कोशिका के GFP अभिव्यक्ति के मूल्यांकन करीं।
CAR-T कोशिका सभ के इम्यूनोकल्ट (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep के साथ पूरक) में 24 घंटा ले निम्नलिखित स्थिति सभ में संवर्धित कइल गइल: बिना उपचारित, 250 μM एडेनोसाइने या 10 mM MNA से उपचारित। पूर्व उपचार के बाद, CAR-T कोशिका सभ के पीबीएस से धो के 20,000 SK-OV-3 कोशिका सभ के साथ मिलावल गइल [ATCC; मैकॉय 5ए मीडियम (सिग्मा-एल्ड्रिच) में 10% एफबीएस आ 1% पेनस्ट्रेप के पूरक 10 पर: 1 के इफेक्टर से टारगेट रेशियो के पूरक इम्यूनोकल्ट मीडियम में तीन प्रति में प्रवर्धित कइल गइल। डिजिटलिस सैपोनिन (0.5mg/ml; सिग्मा-एल्ड्रिच) के साथ लाइज कइल गइल एसके-ओवी-3 कोशिका आ एसके-ओवी-3 कोशिका सभ के क्रम से नकारात्मक आ सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कइल गइल। 24 घंटा के सह-खेती के बाद सुपरनेटेंट के एकट्ठा कइल गइल आ निर्माता के निर्देश (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) के अनुसार लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) के नापल गइल। एलडीएच सुपरनेटेंट के एलडीएच बफर में 1:50 पतला कइल गइल। हत्या के प्रतिशत के माप निम्नलिखित सूत्र के इस्तेमाल से कइल गइल: हत्या के प्रतिशत = सुधार के प्रतिशत / अधिकतम हत्या दर x 100%, जहाँ सुधार के प्रतिशत = खाली सह-संस्कृति-टी कोशिका, आ अधिकतम हत्या के दर = सकारात्मक नियंत्रण-नकारात्मक नियंत्रण।
जइसे कि पाठ भा सामग्री आ तरीका में बतावल गइल बा, सांख्यिकीय विश्लेषण खातिर ग्राफपैड प्रिज्म 8, माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल भा आर v3.6.0 के इस्तेमाल करीं। अगर एकही मरीज (जइसे कि जलन आ ट्यूमर) से कई गो नमूना एकट्ठा कइल जाय तब हमनी के पेयर टी टेस्ट के इस्तेमाल करे लीं या फिर मरीज के रैंडम इफेक्ट के रूप में रेखीय भा सामान्यीकृत मॉडल में उचित रूप से शामिल करे लीं। मेटाबोलोमिक्स विश्लेषण खातिर महत्व के परीक्षण तीन प्रति में कइल जाला।
एह लेख खातिर पूरक सामग्री खातिर, कृपया http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 देखल जाय
ई एगो खुला पहुँच वाला लेख हवे जे क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन-गैर-व्यावसायिक लाइसेंस के शर्त के तहत बितरित कइल गइल बाटे, जवना में कौनों भी माध्यम में इस्तेमाल, बितरण आ रिप्रोडक्शन के इजाजत बाटे, जबले कि अंतिम इस्तेमाल ब्यापारिक फायदा खातिर ना होखे आ आधार ई होखे कि मूल रचना सही होखे। सिफारिश।
नोट: हमनी के रउआँ से खाली आपन ईमेल पता देवे के कहत बानी जा ताकि जवना आदमी के रउआँ पन्ना पर सिफारिश कइले बानी ऊ जान जाव कि रउआँ चाहत बानी कि ऊ ईमेल देखे आ ई स्पैम ना ह। हमनी के कवनो ईमेल पता के कैप्चर ना करब जा।
एह सवाल के इस्तेमाल एह बात के परीक्षण करे खातिर कइल जाला कि रउरा विजिटर हईं कि ना आ स्वचालित स्पैम सबमिशन रोके खातिर.
मारिसा के जी जोन्स), फिनिस टी हैमिल्टन (फिनेस टी.) के नाम से जानल जाला।
एमएनए टी कोशिका सभ के प्रतिरक्षा दमन में योगदान देला आ मानव कैंसर के इलाज खातिर संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य के प्रतिनिधित्व करे ला।
मारिसा के जी जोन्स), फिनिस टी हैमिल्टन (फिनेस टी.) के नाम से जानल जाला।
एमएनए टी कोशिका सभ के प्रतिरक्षा दमन में योगदान देला आ मानव कैंसर के इलाज खातिर संभावित इम्यूनोथेरेपी लक्ष्य के प्रतिनिधित्व करे ला।
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